基于生物信息学稻米半胱氨酸蛋白酶抑制剂来源生物活性肽的虚拟筛选及分子对接研究

稻米半胖氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC)是除贮藏蛋白外一类重要的稻米蛋白,本研究的目的是筛选稻米OC来源的生物活性肽。研究以稻米OC蛋白质序列为对象进行生物信息学分析和计算机辅助酶解,建立OC蛋白虚拟模拟胃肠道消化产物的肽数据库,预测其生物活性肽序列。进一步结合分子对接虚拟筛选具有结合潜力的活性肽并探讨其与靶蛋白的结合位点及作用方式。生物信息学分析表明稻米OC蛋白与大豆球蛋白和稻米谷蛋白类似也是生物活性肽的潜在优良来源;经人体消化酶虚拟水解后能够产生的肽段活性以ACE和DPP-IV抑制为主。分子对接表明虚拟消化产生的两种新的三肽TDW和AGR均能与ACE和DPP-IV活性部位的关键氨基酸残基形成分子间相互作用,对ACE和DPP-IV具有潜在的抑制作用。     

菲律宾蛤仔过敏原原肌球蛋白的鉴定与分子克隆

目的了解菲律宾蛤仔中过敏原的情况,对其主要过敏原进行鉴定和分子克隆。方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹验证原肌球蛋白,双向电泳对蛋白等电点进一步确定。利用差示扫描量热法对蛋白的热性能测定以及蛋白克隆和测序来分析原肌球蛋白。结果菲律宾蛤仔原肌球蛋白的分子量在37 k Da左右,等电点为5.1,热稳定性较强。原肌球蛋白的基因序列全长为855 bp,编码284个氨基酸,对序列进行同源对比,相似性较高。结论本实验证实了原肌球蛋白为菲律宾蛤仔的过敏原,为认识菲律宾蛤仔过敏原提供基础数据。     

马氏珍珠贝来源DPP-IV抑制活性肽的虚拟筛选及其作用机制

为了快速发现马氏珍珠贝来源二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制活性肽,本研究利用数据库中20个已报道的DPP-IV抑制肽组成训练集,构建了药效团模型并通过测试集分子和Fisher随机验证法对模型进行了评估。利用在线网站PeptideCutter,以珍珠贝肉蛋白为原料,进行虚拟酶解。使用最优药效团模型（Hypo1）对虚拟酶解获得的192个低分子肽（氨基酸数小于或等于5）进行初步筛选,接着以分子对接的方法进一步筛选,并且对潜在的DPP-IV抑制活性肽进行固相合成,体外验证其活性并分析其作用机制。结果表明,药效团结合分子对接技术筛选了4个理论上可能具有高活性的DPP-IV抑制肽,即LPIY、VQDR、PIY和APSL。其中,VQDR、PIY没有表现出抑制活性,而LPIY和APSL具有较高的DPP-IV抑制活性,其IC₅₀值分别为521.19 和258.67 μmol/L。与DPP-IV相互作用的机理表明,肽LPIY和APSL与DPP-IV活性口袋中的氨基酸残基形成了多个氢键,且N-端第二个位置的脯氨酸（P）也均与活性口袋中的残基形成了Pi-Alkyl作用,因此促进了LPIY和APSL的DPP-IV抑制作用。本研究为高效筛选珍珠贝来源的DPP-IV抑制肽提供了理论方法。     

菲律宾蛤仔原肌球蛋白线性表位初步预测

目的通过生物信息学,预测菲律宾蛤仔原肌球蛋白的线性表位。方法对菲律宾蛤仔原肌球蛋白同源性、抗原性指数进行分析,利用在线工具预测及综合分析预测表位,进一步与人和猪原肌球蛋白序列对比初步筛选过敏原线性表位。结果 4种软体类的原肌球蛋白同源性较高,且原肌球蛋白的整体性抗原指数较高。菲律宾蛤仔原肌球蛋白中抗原表位区域较多,在与人、猪的序列比较后,最终预测出4个抗原表位。结论预测出了4个线性表位分别为Peptide 2 TLLQKKYTNLENEFDQVNEK,Peptide 6 EKQVKDAKYVAEEADRKYDE,Peptide 9 KDAENRAAEAERVVNKLQ和Peptide 10 ELLAEKEK YKAISDELDQ。     

基于分子对接技术筛选抗SARS-CoV-2海洋活性肽的研究

通过对蓝鳍金枪鱼的肌球蛋白(G9M5T1)进行模拟酶解,得到30条海洋活性肽,与SARS-CoV-S/ACE2复合蛋白、2019-nCoV Mpro水解酶进行分子对接,筛选出与其结合紧密的肽段.由试验结果得到NIRSF,STHPHFVR,DIAGF,IRIHF,ASWMIYTYSG五条对SARS-CoV-2有潜在抑制作用的活性肽.本研究为研发具有抗新冠病毒功能食品提供了新的思路.     

基于分子对接技术从虾夷扇贝中筛选抗SARS-CoV-2活性肽研究

为从食品原料中筛选具有抗2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)能力的生物活性肽段,选用虾夷扇贝肌球蛋白为目标序列,利用计算机对虾夷扇贝肌球蛋白进行模拟酶解,对酶解所得的肽段进行毒性和生物活性预测。选取活性评分超过0.5且无毒性的肽段,以SARS-CoV-S/ACE2复合蛋白和COVID-19 Mpro水解酶为靶标进行分子对接,鉴定其病毒抗性。结果表明:肽段CSNAIPEL可以与SARS-CoV-S/ACE2复合蛋白上的GLN42和GLU329两个关键氨基酸结合,LibDock Score为136.03;肽段LPIY不仅能与SARS-CoV-S/ACE2复合蛋白上的ASP38和TYR491氨基酸结合,还能够与COVID-19 Mpro上的THR24、THR25和THR26氨基酸结合,LibDock Score分别为142.85和168.04;肽段QRPR与COVID-19 Mpro水解酶晶体上的THR24、THR25和THR26氨基酸结合,LibDock Score为154.93。研究表明,肽段CSNAIPEL、LPIY和QRPR三者表现出较好的抗SARSCoV-2能力。本研究旨在为抗新型冠状病毒功能食品的研发提供新的思路。     

仿刺参胶原蛋白源二肽基肽酶抑制肽虚拟筛选及分子对接研究

目的 采用生物信息学和分子对接方法筛选仿刺参胶原蛋白来源的二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV)抑制肽。方法 以仿刺参胶原蛋白序列为对象,进行生物信息学分析和计算机辅助虚拟酶解, 基于生物毒性、致敏性、水溶性及吸收、分配、代谢、排泄及毒性(absorption, distribution, metabolism, excretion, toxicity, ADMET)预测, 筛选得到6条具有潜在生物活性的寡肽, 氨基酸序列分别为CD、CQ、CS、GR、SM、MDG, 进一步通过分子对接分析肽段与DPP-Ⅳ的结合活性, 并分析其结合位点及方式。结果 生物信息学分析表明仿刺参胶原蛋白是生物活性肽的潜在优良来源, 经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及模拟胃肠道虚拟水解后能够释放出DPP-Ⅳ抑制肽; 分子对接表明俩条新肽段CS、SM通过氢键、疏水相互作用分别与DPP-IV的S1、S2活性口袋结合。结论 本研究提供了一种快速筛选刺参胶原蛋白中DPP-IV抑制肽的方法。     

豆粕血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定及作用机制解析

以大豆粕为原材料,利用超声辅助酶解技术、超滤-?KTA层析相结合的方法分离纯化获取豆粕酶解产物中血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制肽,对其分子质量分布进行研究,后通过质谱分析与分子对接技术鉴定并筛选出ACE抑制活性肽的氨基酸序列,经固相合成肽序列,检测其ACE抑制肽的活性并基于分子对接技术探索其抑制机制。结果表明：经超声辅助酶解提取获得的豆粕肽分子质量主要分布在6 000 Da以下;根据分子对接的最低预测自由能筛选出的GVRP（－8.44 kcal/mol）和IIVTP（－9.04 kcal/mol）可以抑制ACE活性,半抑制浓度（50% inhibitory concentration,IC50）分别为（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L;分子对接结果表明：GVRP、IIVTP能够与ACE的活性口袋S1、S1′、S2形成氢键相互作用,共有的过近接触（3.5 ?范围内）ACE氨基酸残基为His513、Ala354和Glu384。本研究基于串联质谱与分子对接技术,建立从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽的方法,探究活性多肽与ACE稳定结合并体现其ACE活性的抑制机制,为后续的深入研究提供一定参考。     

几种南海贝类酶解产物的生物活性及其分子量分布研究

对菲律宾蛤仔、波纹巴非蛤、马氏珠母贝双酶水解产物的自由基清除活性和血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性及分子量分布进行研究。结果表明：3种贝类酶解产物均具有清除羟自由基、超氧阴离子、二苯基苦基苯肼（DPPH）等自由基的活性以及ACE抑制活性;3种贝类酶解产物对超氧阴离子的清除作用均较弱;羟自由基清除活性较强的是菲律宾蛤仔酶解产物,其高活性组分的分子量在1479～851 Da之间;DPPH自由基清除活性较强的是菲律宾蛤仔酶解产物,其高活性组分的分子量在1479～851 Da之间;ACE抑制活性较强的是波纹巴非蛤酶解产物,其高活性组分的分子量在633—303 Da之间。     

阿胶活性肽的结构鉴定及活性筛选

利用液相色谱-串联质谱联用技术鉴定阿胶模拟胃肠道消化产物中肽的结构,并通过分子对接技术从中筛选潜在的降血压、抗老年痴呆和抗肿瘤的活性肽。结果表明,从阿胶消化产物中获得519 种活性肽,其分子质量在661.4～2 851.4 Da之间,主要为胶原蛋白和血红蛋白的酶解产物;获得最具潜力的降血压肽KGETGLR、抗老年痴呆肽SGLDGAKG和抗肿瘤肽ADGVAGPK;氢键相互作用和静电相互作用在阿胶肽发挥降血压、抗老年痴呆和抗肿瘤活性中都起着重要的作用。     

酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺优化及其抑制机制

为优化酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺条件以及筛选和鉴定一种新的ACE抑制肽,选用5种蛋白酶水解酪蛋白,以水解度、分子质量分布和ACE抑制率为指标筛选最适蛋白酶,采用单因素和响应面试验优化工艺,采用三合一质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS)方法鉴定分子质量小于3 ku组分的氨基酸序列,筛选潜在ACE抑制肽,进行人工合成,测定其IC50值。采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学,结合分子对接解析肽段的抑制机制。结果表明:碱性蛋白酶水解酪蛋白的最佳条件为pH 6、底物含量8%、酶添加量4%、温度55 ℃、水解时间90 min,此时酪蛋白水解液ACE抑制率为99.1%。验证具有ACE抑制活性的肽段10条,筛选出一条新颖的降血压肽——LFRQFY(源自αs1-酪蛋白),其ACE抑制活性的IC50为(7.9±1.7)μmol/L,酶抑制动力学为混合抑制模式。分子对接结果表明:LFRQFY能与ACE的氨基酸残基Ala354(活性口袋S1)、His353(活性口袋S2)形成氢键,具有显著的体外降血压活性。     

计算机模拟筛选食用藻蛋白源PAR2抑制肽

该研究主要是通过计算机模拟，从食品来源蛋白质中预测筛选具有蛋白酶激活受体2（Protease Activated Receptor 2，PAR2）抑制作用的生物活性肽，同时预测食用藻类蛋白质酶解后所得的肽段的生物活性、水溶性等理化指标。首先，利用NCBI数据库和蛋白质晶体数据库（Protein Data Bank，PDB）比对选择食用藻类蛋白质，其次通过BIOPEP-UWM数据库模拟酶解，Peptide Ranker进行活性分析，Innovagen和ToxinPred预测高活性肽，最后采用HPEPDOCK将获得的活性评分超过0.5、水溶性优且无毒的小分子活性肽与PAR2进行分子对接模拟，以探究两者之间的分子结合能力，进而分析判别不同小分子活性肽抑制PAR2活力的潜力和机制。结果表明，小分子寡肽PAGR（-165.80）、PAR（-163.93）、IDQW（-152.95）、DISAW（-154.48）与PAR2具有较高的结合分数，是PAR2潜在的活性抑制肽。该研究旨为藻类蛋白的开发利用以及PAR2抑制剂的挖掘研究提供参考。     

蛤蜊肽的制备工艺优化及其增强免疫活性

目的:以菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)为原料,研究蛋白肽制备工艺及其增强免疫活性。方法:以蛋白水解度为评价指标,筛选最适蛋白酶,采用单因素实验和响应面试验确定最佳酶解条件;氨基酸分析仪分析蛤蜊肽氨基酸组成;通过小鼠器官/体重比值、小鼠脾淋巴细胞转化实验、血清溶血素实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、NK细胞活性实验评价蛤蜊肽的增强免疫活性。结果:菲律宾蛤仔蛋白肽制备的最适蛋白酶为胰蛋白酶,最佳酶解条件为温度48.4℃,pH8.0,加酶量3795 U/g,料液比1:2,水解时间4 h,该工艺下蛋白水解度达到15.33%,蛋白肽重均分子量为418 Da;其氨基酸组成合理,必需氨基酸占比达到41.48%;经口给予小鼠不同剂量的蛤蜊肽30 d,与空白对照组比较,小鼠的脏器比值无显著影响(P>0.05),低剂量(700 mg/(kg·d))与高剂量(2800 mg/(kg·d))下能显著提高血清溶血素水平(P<0.05),低剂量(700 mg/(kg·d))与中剂量(1400 mg/(kg·d))下能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率(P&l...     

马氏珍珠贝肉蛋白水解特征及其ACE抑制肽的筛选

为探索马氏珍珠贝肉的水解规律及快速鉴定血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制活性肽,本研究以不同时间（2、4、6、8、10 h）的酶解物为对象,采用三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子质量分布、反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）表征其水解规律。另外,对10 h酶解物进行初步分离纯化,鉴定高活性组分中的肽序列,并采用分子对接的方法对鉴定的肽进行筛选,验证筛选肽的活性,阐释其抑制机理。结果表明,马氏珍珠贝肉在酶解过程中,大分子质量蛋白逐渐水解为小分子肽,在RP-HPLC上出现某一特征峰的富集。初步分离后,发现F2、F3组分具有较高的ACE抑制活性,从这2 个组分中共获得了可信度较高的54 个肽序列。分子对接筛选出6 个潜在的ACE抑制肽,在1 mg/mL时,5 个肽具有不同程度的ACE抑制活性,其中,WFHAVFW和WHAFLW显示了最高的ACE抑制活性,分别为（95.57±0.37）%和（98.59±0.08）%,进一步测定六肽WHAFLW的半抑制浓度（IC50）值,为52.39 μmol/L。分子对接显示肽的抑制机理可能是通过氢键、范德华作用以及Pi-Pi作用形成稳定的肽-酶复合物。本研究既揭示了珍珠贝肉蛋白不同酶解时间的规律变化,又将活性实验跟踪与计算机辅助筛选相结合,提供了一种快速筛选酶解物中高活性ACE抑制肽的方法。     

拟穴青蟹原肌球蛋白抗原表位适配体小肽的筛选与鉴定

目的筛选对拟穴青蟹过敏原原肌球蛋白(tropomyosin,TM)抗原表位具有特异性结合能力的适配体小肽,并鉴定适配体小肽对TM的免疫结合活性的抑制作用。方法采用ExPASy peptide cutter软件预测TM分子中胰蛋白酶酶切位点,结合TM线性表位设计反义小肽,经AutoDock 4.0软件模拟分子对接,筛选得到适配体小肽。采用抑制性ELISA的方法,检测筛选的适配体小肽对TM与特异性IgG抗体结合活性的抑制作用。结果 TM氨基酸序列中有25个胰蛋白酶酶切位点,设计TM的31条反义小肽,利用分子对接筛选得到12个适配体小肽。抑制性ELISA结果显示,12条适配体小肽均能明显抑制TM与IgG抗体的特异性结合,其中适配体小肽5抑制能力最强,其抑制率为36.2%。结论通过分子对接筛选得到能明显抑制TM免疫结合活性的适配体小肽,为降低TM致敏性的研究提供理论参考。     

美拉德反应对菲律宾蛤仔原肌球蛋白结构及免疫活性的影响

以菲律宾蛤仔原肌球蛋白为研究对象,探讨美拉德反应导致核糖糖化后对其结构及免疫原性的影响。利用酶联免疫及点印记技术分析核糖对原肌球蛋白IgE/IgG结合能力的影响。通过圆二色谱（circular dichroism,CD）、有效赖氨酸含量测定等分析蛋白二级结构及相关基团的变化。结果表明,以美拉德反应为基础的与核糖的糖化反应时间达到12 h后,产物的IgE结合能力下降76.2%,IgG结合能力下降了86.8%,α-螺旋含量下降了71.7%,蛋白表面疏水性增加了192%,有效赖氨酸含量降低了45.5%。实验表明,与核糖的糖基化反应时间达到4 h后能够有效地改变菲律宾蛤仔原肌球蛋白的结构,从而降低其免疫活性。     

计算机辅助的蛋白质降血压活性评估方法

目的 借助虚拟水解与分子对接软件, 建立蛋白质降血压活性评估函数。方法 采用Autodock软件将胃肠道蛋白酶水解可能产生的二、三肽与血管紧张素I转化酶(angiotensin I-converting enzyme, ACE)进行分子对接, 根据对接能量值对短肽的ACE抑制活性进行预测, 并对肽的结构特征进行了详细地分析和统计。基于肽段与ACE结合的能量值建立可评估食品蛋白质降血压活性(G值)的打分函数, 并对22条已知氨基酸序列的可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)蛋白质的降血压活性进行评估。结果 对于二、三肽, 由带电荷的氨基酸、芳香族氨基酸和脯氨酸组成的肽段更易与ACE结合, 此外, 酸性氨基酸(带负电荷)所组成的肽段也易与ACE结合。采用打分函数对22条可口革囊星虫蛋白质的降血压活性进行评估, 其中19条蛋白质具有较好的降血压活性。结论 可口革囊星虫是一种良好的降血压肽来源, 计算机辅助的基于对接能量值的ACE抑制活性预测以及打分函数建立对生物活性肽的研究具有重要的参考价值。     

分子对接技术筛选鲈鱼肌球蛋白中黄嘌呤氧化酶抑制肽

传统的蛋白提纯方法需经过分离、收集、纯化和结构解析,过于繁琐且耗时。本文以虚拟酶解及分子对接技术筛选鲈鱼肌球蛋白中黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制肽,利用Discovery studio 2017 R2 Client (DS2017)软件预测其药物代谢动力学(ADMET)性质,并进行分子对接。利用高效液相色谱技术和抑制超氧阴离子自由基试剂盒对筛选出的肽进行活性验证,高效液相色谱条件为:柱温45℃,流动相=V_(甲醇)∶V_(混合液)(V_水∶V_(冰乙酸)∶V_(四丁基氢氧化铵)=997∶1.5∶1.5)=5∶95,检测波长254 nm,流速0.5 m L/min,进样量10μL。最终成功筛选到1个六肽DEEIDN,其ADMET性质良好,并可与XOD结合。活性验证结果显示其具有良好的XOD抑制率,半抑制浓度IC_(50)值为0.503 mg/m L,且可有效清除对人体产生损伤的超氧阴离子。     

烹煮时间对菲律宾蛤仔质构及烹煮液性质影响的研究

研究不同烹煮时间下菲律宾蛤仔烹煮液中蛋白质及总糖含量、抗氧化活性及菲律宾蛤仔肉质构的变化。研究发现随烹煮时间的增加,烹煮液中蛋白质和总糖浓度上升,在烹煮20min时,烹煮液中蛋白质及总糖浓度分别为6mg/m L及181.1μg/m L。烹煮液清除羟基自由基及ABTS+自由基能力均高于未烹煮时菲律宾蛤仔浸出液,而烹煮5min以后,烹煮时间对烹煮液清除自由基能力的影响不显著。菲律宾蛤仔肉的硬度、弹性、内聚性及耐咀性在5min后显著升高(p0.05),而各烹煮时间之间,变化不显著。研究结果表明,菲律宾蛤仔烹煮5min后,菲律宾蛤仔肉质构变化不显著,在实际加工过程中,可以将菲律宾蛤仔烹煮时间定为5min,同时烹煮液中含有蛋白质、多糖成分及抗氧化活性物质,适合继续加工利用。     

预酶解对玛咖蛋白胃肠消化及免疫调节活性的影响

为探究不同蛋白酶预酶解对玛咖蛋白胃肠消化程度及消化产物免疫调节活性的影响,该研究选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及复合蛋白酶分别对玛咖蛋白进行预酶解,再经模拟胃肠消化得到五组消化产物。利用TNBS法、福林酚法等测定消化产物的得率、水解度、可溶性肽含量及游离氨基酸含量,再以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为模型探究消化产物的免疫调节活性。结果表明,经五种蛋白酶的预酶解,玛咖蛋白消化产物的水解度、可溶性肽含量和游离氨基酸含量分别提高了35%、5%~16%及37%~92%,且消化产物促进巨噬细胞分泌TNF-α的作用无明显降低。经菠萝蛋白酶预酶解得到的消化产物的免疫调节活性最高,该消化产物含有15 154条分子量小于3 000 u的肽段;在经活性评分及分子对接预测的与TLR2和TLR4受体存在相互作用最强的10个肽段中,NPYPFFGFSI的免疫调节活性最高;HOMO分析结果表明该肽的活性位点位于酪氨酸上。上述结果表明预酶解可在不影响玛咖蛋白免疫调节活性的条件下提高玛咖蛋白的可消化性。