利用生物素链霉亲和素放大酶联免疫方法检测猪肉中莱克多巴胺残留

以酶联免疫方法为基础.结合生物素-链霉亲和素系统的放大作用,建立直接竞争生物素链霉亲和素放大酶联免疫(BA-ELISA)检测方法,并将其用于猪肉肌肉组织中莱克多巴胺残留的检测,方法灵敏度(IC50)为(0.3±0.05)ng/mL,样品检出限为(0.3+0.1)ng/kg,平均加标回收率在84%以上.     

免疫磁珠——环介导等温扩增快速检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL

建立了免疫磁珠分离（IMS）结合环介导等温扩增（LAMP）检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tet L的方法。结果表明：经优化后,每微克链霉亲和素纳米磁珠与375 ng生物素标记的芽孢杆菌抗体偶联,在含有1×103 CFU/mL耐四环素蜡样芽孢杆菌的巴氏杀菌乳中,25μL免疫磁珠孵育1 h后,对蜡样芽孢杆菌BA117的捕获率为68.1%。该IMS-LAMP方法特异性高,2 h内对巴氏杀菌乳中耐四环素蜡样芽孢杆菌的检测灵敏度为24 CFU/mL。IMS-LAMP方法具有用时短,灵敏度高,操作简单等优点,可以有效检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因。     

血清铁蛋白化学发光免疫分析方法的建立及临床应用

利用链霉亲和素-生物素放大系统及双抗夹心法,建立检测血清铁蛋白的化学发光免疫分析方法。将生物素、辣根过氧化物酶分别标记铁蛋白的一对抗体,以链霉亲和素包被96孔发光板,铁蛋白标准品与国际标准品进行溯源,并对本法的各项性能指标进行评价。收集300份临床血清样本,使用本法与进口试剂盒同时检测,检测结果显示:相关系数r为0.97,本法的线性测量范围为10～800 ng/mL,灵敏度为0.2 ng/mL,批内、批间的变异系数(CV%)分别为3.4%～5.5%及5.0%～7.3%,与癌胚抗原、人白蛋白、人类心脏铁蛋白以及血红蛋白交叉反应率均小于1%。本法37℃、9 d热稳定性良好。表明所建立的方法各项指标均满足临床检测要求,抗体及样本用量少,操作简便,反应迅速,便于临床应用,可替代国外同类试剂盒。     

基于纳米金棒刻蚀的多色可视化传感器应用于乌头碱快速检测

目的基于纳米金棒刻蚀的多色可视化传感器快速检测乌头碱。方法采用H2O2-辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)-3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)体系的氧化产物TMB2+刻蚀纳米金棒,产生不同颜色的溶液,并将其与酶联免疫吸附测定法联用,构建一种酶联免疫多色可视化传感器应用于乌头碱快速半定量分析。结果在最优条件下,纳米金棒溶液的局域表面等离子体共振吸收峰的位移与乌头碱浓度在5~35ng/L范围内呈现较好的线性关系,检出限为1.67ng/L。结论该方法具有快速、选择性好、灵敏度高、裸眼可视化半定量等优点,对乌头碱的快速检测有一定的实际应用价值。     

基于脲酶-金纳米棒的双重放大免疫比色法快速检测食品中黄曲霉毒素B1

该研究提出了一种免疫比色方法用于快速检测黄曲霉毒素B1 。在最优条件下,以免疫磁珠为载体,脲酶-金纳米棒为探针,探针与抗体特异性结合的同时与尿素反应催化沉积外加铜离子产生的显色反应为定量基础,紫外吸收强度作为参考指标,测定样品中的黄曲霉毒素B1 。结果表明,标准曲线的线性回归方程为Y=4.017+1.430 6X,相关系数为0.997,检测限为0.042 ng/mL,加标回收率在92.5%～120.8%之间,表明该方法精密度良好、检测结果可靠。故该免疫比色法可用于检测食品中黄曲霉毒素B1。     

肠毒素大肠杆菌K88可视化快速检测方法的建立

本研究通过肠毒素大肠杆菌(E.coli)K88菌毛蛋白的适配体识别,结合纳米金标记和银增强信号放大技术,建立了一种快速、灵敏、特异的E.coli K88可视化快速检测方法。该检测方法是将能与E.coli K88特异性结合的生物素化的适配体1(aptamer 1),与目标菌E.coli K88以及纳米金-巯基化适配体2轭合物(aptamer 2-Au NPs)在一定条件下孵育,形成三明治式的aptamer 1-E.coli K88-aptamer 2-Au NPs复合物,随后通过生物素与亲和素的结合将复合物固定到修饰了链霉亲和素的微孔板上,最后运用银增强显色将反应信号放大。通过对检测方法条件的优化,本方法可特异、定量地检测E.coli K88,在1.0×10~1~1.0×10~5 cfu/孔目标菌范围内,其定量拟合线性曲线决定系数R2可达0.9903,且检测灵敏度达10 cfu/孔,而检测其它非目标菌株均为阴性。本方法为E.coli K88在临床样品中的可视化检测奠定了基础。     

免疫竞争比色传感用于测定小麦中呕吐毒素的方法研究

目的 基于磁分离竞争免疫和酶催化比色传感技术建立一种呕吐毒素快速检测方法。方法 将抗体对呕吐毒素的特异性识别与辣根过氧化物酶催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺/双氧水的比色反应相结合,考察了酶催化显色反应的可行性和线性范围,优化了反应温度和反应时间。呕吐毒素检测过程集成自动化反应装置和高通量终端检测设备,以DON抗体功能化的磁性微粒为固相载体,优化了磁珠用量、酶标抗原浓度和免疫亲和反应时间。结果 呕吐毒素在0~1750ng/mL浓度范围内与催化反应产物的吸光度呈良好的线性关系,线性相关系数为0.98。以该方法对小麦基质进行加标回收,回收率在81.3%~90.3%之间,相对标准偏差小于2.1%,检测结果经液相色谱-质谱联用法验证相关性良好。结论 本方法具有较高的灵敏度和准确度,且自动化程度较高、操作较为便捷,有潜力应用于粮食样品中呕吐毒素的现场检测。     

表面等离子共振技术快速检测食品中的 玉米赤霉烯酮毒素

目的建立基于表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术快速检测食品中玉米赤霉烯酮毒素(zearalenone,ZEN)的方法。方法采用表面自组装技术(self-assembled monolayer,SAM)在金膜的表面修饰羧基基团,将ZEN抗原与牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)偶联物(ZEN-BSA)通过共价键固定在芯片的表面,采用竞争法检测样品中的玉米赤霉烯酮毒素。结果该方法的检测限为8.2 ng/m L,ZEN单克隆抗体与呕吐毒素、黄曲霉毒素B_1、赭曲霉毒素、伏马毒素等没有交叉反应,与α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇交叉反应率分别为15.3%和11.5%。结论本方法具有简便、快速和高灵敏度等优势,在食品中真菌毒素的快速检测方面具有潜在的应用价值。     

免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌

建立免疫磁珠分离（immunomagnetic separation,IMS）联合环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测牛肉中鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的方法。用生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体对链霉亲和素磁珠进行功能化,从牛肉中捕获和分离目标致病菌。结果表明：经优化后,每毫克磁珠与10 μL鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联,400 μL鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠在45 min内对104 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的捕获率为52.16%;每毫克磁珠与6 μL金黄色葡萄球菌抗体偶联,300 μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠在30 min内对104 CFU/mL金黄色葡萄球菌的捕获率为56.80%;建立的IMS-LAMP方法特异性高,对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度为1.2×103 CFU/mL,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为4.4×104 CFU/mL;富集5 h后,鼠伤寒沙门氏菌的检测限可至1.2 CFU/mL,富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用时短,灵敏度高,操作简单,可以有效检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

基于发卡型DNA循环杂交放大技术检测海产品中的Hg~(2+)含量

利用发卡型DNA的循环杂交放大作用和碱基T与Hg~(2+)之间的稳定结构,设计了一种高灵敏性的表面增强拉曼生物传感器用于海产品中痕量汞的检测。首先制备了携带有大量拉曼信号分子的纳米金生物条码作为拉曼信号探针。然后通过酰胺键将捕获DNA固载在磁珠表面上,利用T-Hg~(2+)-T形成的稳定结构和链式循环杂交反应放大技术,将含有大量拉曼信号DNA分子的纳米金颗粒通过生物素和链霉亲和素的特异性结合到磁珠上,最后通过SERS技术实现了溶液中Hg~(2+)的检测。最佳实验条件下,当固定磁珠捕获DNA浓度为1.0×10~(-7) mol/L,Tris-HCl缓冲溶液为p H 7.4,37℃下杂交反应3 h后,Hg~(2+)的浓度与拉曼信号强度呈良好的线性关系,测定线性范围为1.0×10~(-7)~1.0×10~(-13) mol/L,检测限1.0×10~(-13) mol/L(S/N=3)。该传感器用于海产品中Hg~(2+)的测定,测定值与ICP-AES的测定值基本一致。     

基于桥接DNA的实时荧光定量PCR高灵敏检测沙丁胺醇

建立一种基于免疫磁珠、桥接DNA与实时荧光定量聚合酶链式反应技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)相结合的高灵敏、特异性检测沙丁胺醇(salbutamol,SAL)的方法,通过抗体特异性识别两个邻位连接探针,在桥接DNA的桥接作用下将两个邻位探针连接形成全长扩增子,以此为模板进行qPCR实现信号放大。结果表明,方法检测SAL的线性范围为1.0×10^-2 ng/mL^1.0×10^3 ng/mL,检出限为1.2×10^-2 ng/mL,测定自来水及人工尿液样品中SAL的加标回收率在87.1%~111.7%之间。通过免疫磁珠提高检测的效率,通过桥联DNA提高特异性,通过变温扩增提高检测方法的灵敏度以及适用性,搭建高特异性、通用的检测平台,实现对沙丁胺醇的高灵敏检测。     

基于免疫磁珠的胶体金免疫层析法快速检测水产品中地西泮残留

本研究针对水产品中地西泮残留的问题,建立了一种快速、灵敏的免疫磁珠-胶体金免疫层析法。采用链霉亲和素磁珠与生物素化地西泮单克隆抗体偶联制备的免疫磁珠,快速富集、分离水产品中地西泮残留,并结合胶体金免疫层析法进行半定量检测。结果表明,经过优化后试剂卡最佳工艺为金标抗体标记量25 μg/mL、T线抗原包被量0.6 mg/mL、C线羊抗鼠二抗包被量1.5 mg/mL、金标喷量3.0 μL/cm,地西泮加标浓度为1.0、5.0、10.0和15.0 μg/kg时回收率为78.34%~90.40%,相对标准偏差(RSD)为5.03%~8.96%。本方法特异性强、稳定性好,可在25 min内完成单个样本检测,对水产品中地西泮残留检出限为0.5 μg/kg,优于常规前处理法。经验证,对40份水产品样本检测结果与GC-MS法结果一致,证明免疫磁珠-胶体金免疫层析法可作为水产品中地西泮残留快速检测的有效手段。     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。     

免疫磁珠分离技术在食源性致病菌检测中的应用

免疫磁珠(immunomagnetic beads, IMB)是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子, 由载体微球和免疫配基结合而成。免疫磁珠分离技术(immunomagnetic beads separation techniques, IMBS)则是利用免疫磁珠上包被的特异性抗体与抗原发生亲和反应, 从复杂的样品中分离到目标抗原。再利用磁珠的磁响应性, 实现对目标抗原的富集。在食源性致病菌检测方面, 该技术通过与其他检测手段相结合而得到广泛应用, 具有灵敏度高、检测时间短、操作简单等优势。本文综述了免疫磁珠的结构特点、免疫磁珠分离技术的原理, 着重阐述了该技术在食源性致病菌检测方面的应用进展, 以期为免疫磁珠分离技术的广泛应用提供参考。     

免疫磁珠捕获PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

利用免疫磁珠富集单核细胞增生李斯特氏菌,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增进行快速检测。所制备的免疫磁珠选取在37 ℃条件下均匀振荡1 h为最佳包被条件,1 mg磁珠偶联抗体的最佳量为100 μg/mg,制备的免疫磁珠捕获率为45%。所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术在样品细菌浓度达到104 CFU/mL即可被检出,其灵敏度是直接PCR检测限（105 CFU/mL）的10 倍,可为病原菌的富集和快速检测提供新方法。     

Urease-induced metallization of gold nanorods for the sensitive detection of Salmonella enterica Choleraesuis through colorimetric ELISA

We applied urease-induced silver metallization on the surface of gold nanorods (AuNR) to improve colorimetric ELISA for the rapid and sensitive detection of Salmonella enterica Choleraesuis. To this end, we introduced a biotin-streptavidin system as a bridge to determine the correlation between urease and S. enterica Choleraesuis concentrations. The captured urease can catalyze the hydrolysis of urea into carbon dioxide and ammonia, and the generated ammonia can then induce the deposition of silver shell on the surface of AuNR in the presence of silver nitrate and glucose. With the decreased aspect ratio (length divided by width) of AuNR, a multicolor change of AuNR solution and a significant blue shift in the longitudinal localized surface plasmon resonance absorption peak (Δλ_max) of AuNR were obtained at the target concentrations of 1.21 × 10¹ to 1.21 × 10⁸ cfu/mL. Consequently, the detection limits of our proposed colorimetric ELISA were as low as 1.21 × 10² cfu/mL for qualitative detection with naked eyes, and 1.21 × 10¹ cfu/mL for quantitative detection, in which changes in Δλ_max of AuNR were recorded with a microplate reader. These values were at least 2 to 3 orders of magnitude lower than those obtained with conventional horseradish peroxidase-based ELISA. The analytical performance of our developed colorimetric ELISA in terms of selectivity, accuracy, reliability, and practicability were investigated by analyzing S. enterica Choleraesuis-spiked pasteurized whole milk samples.     

A novel method for the determination of sodium chloride in salted fish

A novel, simple and reliable spectrophotometric method to determine sodium chloride in salted fish was developed and validated. The method was based on the reaction of chloride with silver nitrate and the determination of turbidity of silver chloride formed. The absorbance was measured at 385 nm. The method was tested under various conditions, and we confirmed an optimal operation with 2 mL 1:4 (v/v) nitric acid, 2 mL 1.5 g L^?1 gelatin, 5 mL 0.5% silver nitrate in a total volume of 50 mL, mixed and heated at 60 °C for 10 min. The range of linearity and the detection limit were 0.4–24 mg L^?1 and 0.2 mg L^?1, respectively. The relative standard deviations and the recovery were 0.83% to 2.87% and 93.74% to 103.6%, respectively. The accuracy of this method was comparable with Volhard method, and it was cheap and successfully applied to determine sodium chloride in salted fish.     

Development of a Simultaneous Lateral Flow Strip Test for the Rapid and Simple Detection of Deoxynivalenol and Zearalenone

The objective of this study was to develop a 1‐step simultaneous lateral flow strip test for the rapid and simple detection of deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEA) in grains. Two monoclonal antibodies (MAbs) against DON and ZEA were respectively conjugated with gold nanoparticles and used to develop a lateral flow strip test for a single toxin and multiple toxins. First, individual lateral flow strips for a single toxin were optimized, and their conditions were used to develop a simultaneous lateral flow strip for multiple toxins. Limits of detection of both lateral flow strip tests for DON and ZEA were the same (DON: 50 ng/mL, ZEA: 1 ng/mL). Both methods showed cross‐reactivity for α‐zearalenol and β‐zearalenol, but no cross‐reaction to other mycotoxins. The results can be completed obtained within 15 min. The cut‐off values of the simultaneous lateral flow strip for the spiked rice and corn were 500 and 10 ng/g for DON and ZEA, respectively. The results demonstrated that the developed simultaneous lateral flow strip test offers a rapid, easy‐to‐use, and portable analytical system and can be used as a convenient qualitative tool for the on‐site detection of DON and ZEA in food and agricultural commodities.