蛹虫草转录组分析及类胡萝卜素生物合成相关基因的挖掘

基于培养基显著影响蛹虫草类胡萝卜素的生成，采用高通量测序技术探究不同培养基培养的蛹虫草菌丝（CM10_RL和CM10_WL）的转录组差异，经生物信息学分析挖掘蛹虫草类胡萝卜素的生物合成相关基因。结果表明，样品CM10_WL的类胡萝卜素含量显著高于样品CM10_RL的类胡萝卜素含量；相对于样品CM10_RL，在样品CM10_WL中检测到318 个上调表达基因和618 个下调表达基因。基因本体论功能富集结果表明差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）主要富集在代谢过程、细胞膜、催化活性条目中。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集结果表明DEG主要富集在代谢途径。蛹虫草转录本与KEGG数据库中的类胡萝卜素生物合成途径比对结果表明基因CCM_06728和CCM_09155参与类胡萝卜素的生物合成。本研究为进一步阐明蛹虫草类胡萝卜素的生物合成途径奠定基础。     

蛹虫草中谷氨酰胺转氨酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

谷氨酰胺转氨酶(TGase或TG)是一种可催化蛋白质间形成异肽键,使蛋白质改性的天然酶制剂。本文以蛹虫草基因组为模板,通过PCR扩增得到TGase相似蛋白的基因片段tgM,将其与大肠杆菌-毕赤酵母穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-TG,在毕赤酵母中进行表达,实现目的蛋白的胞外分泌表达,结果发酵液中重组TGase的酶活力为100 U/L。本研究为TGase的异源表达及潜在的工业应用提供参考。     

核糖核酸还原酶基因对虫草素的转录调控作用

检测和分析核糖核酸还原酶大亚基（RNR-LC）基因、小亚基（RNR-M2）基因在不同蛹虫草菌株中mRNA的相对表达量与虫草素含量的变化关系，探究核糖核酸还原酶在虫草素合成途径中的转录调控作用。检测不同蛹虫草菌株虫草素含量，采用荧光PCR技术对蛹虫草RNR-LC基因、RNR-M2基因表达的mRNA进行定量分析，并应用双内参基因对试验数据进行校正。以虫草素含量最低的野生蛹虫草组为对照，米基虫草组RNR-LC、RNR-M2基因的mRNA表达量分别是野生蛹虫草组的1.28倍和1.47倍，蚕蛹虫草组分别是其2.35倍和3.84倍。与对照组相比，RNR-M2 mRNA表达随虫草素的增加总体呈现升高的变化规律。两种基因在不同蛹虫草菌株中的相对表达量存在显著性差异（p<0.05）。RNR-M2基因在高虫草素菌株中存在明显的表达优势，而RNR-LC基因表达量与虫草素含量无明显变化关系，二者不存在协同调控作用。推测RNR-M2基因在虫草素合成途径中起着重要的正向调控作用。     

烟草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆与序列分析

为揭示类胡萝卜素双加氧裂解酶基因(CCDs)在烟草生长发育过程中的功能,通过RT-PCR技术克隆到烟草的类胡萝卜素双加氧裂解酶4基因(NtCCD4),编码区1806 bp,编码601个氨基酸,基因序列提交NCBI,GenBank登录号为JF947192.根据氨基酸组成对NtCCD4基因编码蛋白的疏水性/亲水性、蛋白结构及进化关系等进行预测和分析.结果表明:烟草NtCCD4基因编码的蛋白分子量为65936.3 Da,等电点为6.58,定位在叶绿体膜上,为一个稳定的亲水性蛋白;二级结构预测显示此蛋白结构以无规则卷曲(57.4％)为主,α螺旋(13.31％)和β转角(6.61％)所占比例相对较少;进化分析表明NtCCD4是类胡萝卜素双加氧裂解酶基因( CCDs)家族中的一个成员,与其他物种的CCD4蛋白比较显示NtCCD4编码的蛋白含有多个保守区域,其中4个组氨酸残基是组成蛋白功能域所必须的,它们与Fe2+结合共同组成蛋白酶的活性中心.     

蛹虫草类胡萝卜素提取工艺的研究

目的:研究蛹虫草中类胡萝卜素的提取工艺。方法:采用正交试验法进行优选,分光光度法测定类胡萝卜素含量。结果:酸热法对蛹虫草中类胡萝卜素的提取有显著性影响。结论:最优提取组合为盐酸浓度1mol/L、盐酸用量15mL/g、酸浸时间20min、热处理时间4min,丙酮是从蛹虫草中浸提类胡萝卜素较优越的有机溶剂;在此浸提条件下,蛹虫草中类胡萝卜素含量可达2158μg/g干样品。     

黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质

作者从蜡样芽孢杆菌F1-5-10中提取DNA,通过PCR克隆得到褐藻胶裂解酶基因后,将其构建到pET-30a(+)上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,继而对纯化得到的褐藻胶裂解酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究。实验结果表明:PCR扩增出1035bp大小的褐藻胶裂解酶基因algl(GenBank登录号:GU585575),SDS-PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为45 000的特异性蛋白质条带。表达条件优化实验结果表明0.4mmol/L浓度的IPTG 32℃诱导4h重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白质质量的36%。测定褐藻胶裂解酶酶活性,酶活力为11.7U/mg。酶学性质研究表明:ALGL的酶活最适温度为35℃,热稳定性较差,最适pH值为6.6,Ca2+、Mg2对酶活有激活作用,ALGL催化褐藻胶的Km值为1.89mg/mL,Vmax为15.01U/mL。     

黄杆菌肝素酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒Pet-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性.结果 PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到Pet-22b表达载体中.重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS.PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因.     

黄杆菌肝素酶Ⅱ的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)的基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增出黄杆菌HepⅡ的基因,经验证后插入到表达质粒pET-28a上构建表达载体,重组质粒转化E.coli BL21(DE3)进行蛋白质表达。结果成功地将PCR扩增得到的测序正确的HepⅡ基因构建入pET-28a载体上,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白,测活显示重组HepⅡ具有活性。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepⅡ基因。     

烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

成熟叶片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况,本研究以普通烟草红花大金元为材料,采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示,烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和LYCE呈现下调表达,类胡萝卜素降解基因LOX、POD和CCD1呈现上调表达,PAL和PPO呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因ZEP、NXS、NCED呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因ORANGE、HY5、COP1、DET1呈现下调表达,而MYB5b、Cry-2呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老,类胡萝卜素合成减弱,而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。     

蛹虫草新型色素的研究进展

蛹虫草[Cordyceps militaris(L)Link],又名北虫草,是一种菌虫复合体,是虫草属真菌的模式种。蛹虫草在其菌丝和子实体阶段能合成类胡萝卜素,其合成的类胡萝卜素大部分是稀有的水溶性类胡萝卜素和北虫草黄素。北虫草黄素作为一种天然色素,具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种功效,可溶于水,着色效果好,在食品上有更广泛的应用空间,是亟待开发的一类具有活性功能的新型色素。本文就蛹虫草类胡萝卜素的产生、种类与性质、分离纯化和基因工程等研究状况进行了概括和归纳,希望能对后续的研究提供一些理论指导。     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶侧翼调控序列的克隆与分析

研究表明八氢番茄红素合成酶( PSY)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素代谢途径中的第一个关键调节酶.本实验采用基于LAoPCR的基因组步移法分别设计两组基因特异引物pSP1-3及tSP1-3,克隆巴氏杜氏藻PSY( DbPSY)的启动子和终止子序列,并利用在线启动子分析软件分析其保守调控序列.最后利用生物信息学方法分析预测DbPSY的蛋白质结构.分析结果表明,DbPSY启动子具有两个保守调控序列:BOXLCOREDCPAL和GT1GMSCAM4,其中BOXLCOREDCPAL受紫外光诱导,上调下游基因的表达,GT1GMSCAM4受盐调控,促进下游基因的表达.蛋白结构分析表明,DbPSY的N端在邻近物种间具有较大的多样性.我们推测DbPSY的微调与启动子保守序列及蛋白质N端序列的多样性相关.     

海洋来源褐藻胶裂解酶及其基因B1SM的克隆和表达

从海洋来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.) B1基因组中克隆1个褐藻胶裂解酶基因,并在大肠杆菌中实现异源表达,分离纯化重组酶并研究其酶学性质。通过Touch down PCR与热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)从假交替单胞菌B1基因组中扩增到1个褐藻胶裂解酶基因(B1SM),将目的基因插入到p GEX-4T-1载体,转化到宿主大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli) BL21 (DE3)。结果显示,从菌株B1克隆得到褐藻胶裂解酶基因B1SM,序列长度为1 005 bp,编码334个氨基酸,理论等电点为8. 51,编码蛋白质的理论分子质量为37. 13 k Da。重组褐藻胶裂解酶B1SM的最适pH和温度分别为8. 0和25℃。该褐藻胶裂解酶在pH 7. 0～9. 0范围内,25℃下保温1 h,仍剩余60%以上活力,pH稳定性较好。在最适pH 8. 0和30℃下保温1 h重组酶仍剩余60%以上活力。该研究为褐藻胶裂解酶基因B1SM在E. coli BL21(DE3)中实现了异源表达,为褐藻胶裂解酶的制备和研究奠定基础。     

烟草类胡萝卜素降解关键基因CCD1的克隆与表达分析

烟草类胡萝卜素是烟叶重要致香物质的前体物,利用RACE方法获得了烟草品种K326类胡萝卜素降解关键基因CCD1的2个cDNA全长序列。序列分析表明,CCD1-1与CCD1-2各包含一个1635和1647bp的开放读码框(ORF),编码544和548个氨基酸。分别与林烟草和绒毛状烟草CCD1存在一个碱基的差异。CCD1-1与CCD1-2基因序列GC含量为43.24%和42.87％。预测的蛋白质分子量均为61 kDa, 理论等电点 (pI) 6.51和6.55。与番茄和辣椒等植物的类胡萝卜素CCD1的同源性达到80％以上。跨膜区预测表明分别在138～158和142~162位氨基酸间有1个跨膜螺旋区。蛋白质二级结构分析表明,均以β折叠和无规则卷曲为主。蛋白三维结构预测分析表明CCD1-1与CCD1-2空间结构极为相似。组织表达分析表明,CCD1-1与CCD1-2在花中的表达最强,根中的表达最弱,茎和叶次之。这些结果为进一步研究类胡萝卜素降解基因的功能提供了依据。      

蛹虫草类胡萝卜素的热酸-超声复合提取工艺的研究

以光照后的多株蛹虫草菌丝体为原料,对其所含的类胡萝卜素进行提取,并检测其含量。丙酮是从蛹虫草中浸提类胡萝卜素的较好溶剂,酸热后超声波辅助提取为提取类胡萝卜素的较好方法。通过单因素试验和正交试验,得出最佳提取条件为:酸用量15 mL/g(干重),盐酸浓度1 mol/L,酸浸30 min,沸水浴5 min,丙酮浸提140 min,超声波50 min。在此条件下,对多株蛹虫草进行了类胡萝卜素总量的测定,结果表明30号菌株中类胡萝卜素含量可达2984μg/g。     

DCE-01菌株果胶酯酶基因克隆与表达

从麻类脱胶高效菌株DCE-01中克隆果胶酯酶基因并进行原核表达.根据全基因组测序注释结果设计引物,PCR扩增果胶酯酶基因连接到pEASY-E1载体上,导入大肠杆菌进行诱导表达,采用水解圈法进行选择和定量分析.结果表明:克隆出全长1107bp的果胶酯酶基因(GenBank登录号:KC422449),编码368个氨基酸;该基因表达蛋白质序列的前26个氨基酸为信号肽,前导蛋白的分子量约为39.6ku,成熟蛋白为36.9 ku,pI为9.1;基因工程菌株以高度酯化橘子果胶为底物的发酵液粗酶活为1.5IU/mL,是原始菌株DCE-01的22.4倍.本研究成功发掘出果胶酯酶基因,其表达产物果胶酯酶能降解高甲氧基果胶,在低甲氧基果胶制备方面具有重要应用前景.     

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

定量检测食品中榛果过敏原成分

定量检测食品中过敏原榛果过敏蛋白,构建目的基因的标准品及标准曲线。以榛果的DNA为模板,针对油体蛋白基因设计引物进行PCR扩增,构建质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。成功克隆油体蛋白目的基因片段,并以此为标准制作出荧光定量PCR标准曲线,线性关系良好,灵敏度高,检测限低于10个拷贝,特异性强,准确可靠。成功建立荧光PCR方法定量检测食品中过敏原榛果成分,构建油体蛋白基因的标准品及标准曲线。     

白菜型油菜八氢番茄红素合酶基因BrPSY的克隆与序列分析

八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素合成途经的第一个关键限速酶,对类胡萝卜素合成起着重要的控制作用。本研究利用电子克隆技术,从油菜EST数据库中找到与拟南芥PSY,基因高度同源的油菜EST序列,通过人工拼接及lit—PCR、RACE的方法,克隆得到白菜型油菜BrPSY基因全长eDNA的序列,提交GenBank,被命名为BrPSY（GenBank登记号EUl38883）。BrPSY包含168bp的5’前导序列、69bp的3’不翻译序列和1278bp的完整开放读码框（ORF）,编码47．6kOa的蛋白质。序列比对结果表明,BrPSY蛋白与其它植物的PSY蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,BrPSY与拟南芥亲缘关系最近。在全长eDNA序列的基础上,设计引物从白菜型油菜DNA中克隆得到BrPSY基因的全长DNA序列,含有7个外显子和6个内含子。