实时荧光PCR在食源性致病菌监测中的应用研究

目的 建立沙门菌、志贺菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌O157:H7、金黄色葡萄球菌5种致病菌的实时荧光PCR检测方法,并在食源性致病菌监测工作中推广应用.方法 将菌株及样品经培养基增菌后,用热裂解法提取DNA,使用荧光定量PCR反应试剂盒,时该检测方法进行特异性验证,并在2006-2007年间,同时应用实时荧光PCR和传统方法对890份各类实际工作监测标本进行比较分析.结果 实时荧光PCR方法对19株不同种类标准菌株符合率为100%;对用传统方法检测分离到的5种食源性致病菌的符合率分别为:沙门菌96.61%,单核细胞增生李斯特菌92.30%,大肠埃希菌O157:H7、志贺菌、金黄色葡萄球菌均为100%;对890份监测标本检测结果表明,实时荧光PCR法对食品及临床标本中食源性致病菌的检出率略高于传统培养法,差异无统计学意义,而实时荧光PCR法可在3～36 h内时目标样品作出结果判断.结论 实时荧光PCR方法成功应用于食源性致病菌的检测,具有快速、特异和灵敏的特点,可作为食物中毒等突发公共卫生事件处置和重大活动食品安全保障工作的有效技术支撑.     

Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的Taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d~7 d缩短为仅需2 h~3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。     

荧光型重组酶聚合酶扩增技术检测食品中大肠埃希氏菌O157

研究基于荧光型重组酶聚合酶扩增(exo-RPA)技术原理,建立了一种大肠埃希氏菌O157的快速检测方法。应用该方法对多种大肠埃希氏菌O157菌株和非大肠埃希氏菌O157菌株的检测结果表明,该方法的荧光探针和引物具有良好的特异性。对于梯度稀释的插入靶基因序列的质粒pUC57-rfbE和大肠埃希氏菌0157的检测,大肠埃希氏菌O157 exo-RPA检测灵敏度分别可以达到10~2 copies/μL和2.1×10~4 cfu/mL。对食品样品中大肠埃希氏菌0157的检测,exo-RPA方法显示出了良好的稳定性。并且食品样品中目标菌经4 h增菌后,该方法的灵敏性可以满足对食品样品中初始浓度为2.1×10~1 cfu/mL的目标菌的检测。因为大肠埃希氏菌exo-RPA方法配套设备简便、廉价,所以该方法可以在各级检测机构中推广,并适用于食品生产到消费各环节中大肠埃希氏菌0157的即时检测。     

食源性单增李斯特菌的实时定量PCR检测

根据GenBank数据库单增李斯特菌的O基因序列(AF253320)设计引物,建立单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测方法。标准曲线的相关系数为0.996,检出底限约8个细菌/反应,而常规PCR检出底限约60个细菌/反应。比较常规PCR和实时荧光定量PCR对人工污染样品检测,发现实时定量PCR也具有较高的灵敏度;对40份牛奶和40份火腿样品进行检测,阳性率分别为12.5%和10%,与传统细菌分离检测结果完全相符。因此,实时定量PCR检测单增李斯特菌具有快速、灵敏的优点,适宜于食品中单增李斯特菌污染的调查及监测。     

免疫磁珠富集联合荧光定量PCR快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌O26∶H11

建立肉制品中免疫磁珠富集(IMS)联合实时荧光定量PCR(qPCR)技术快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O26∶H11的方法。方法 建立针对编码O26抗原wzx基因实时荧光定量PCR方法,并验证其特异性和敏感性;人工污染不同浓度STEC O26∶H11的牛肉馅样品,在增菌不同时间后,将增菌液原液、增菌液经免疫磁珠特异性捕获分离物分别进行qPCR检测及平板分离。结果 qPCR检测O26∶H11可产生特异性荧光信号,而23株其他血清型的大肠埃希菌及7株其他种属细菌均未见荧光信号;本方法对纯培养的检测限为5×10^2cfu/ml。人工染菌试验中,当初始染菌浓度达到或高于3×10^2cfu/25g时,增菌培养6h后IMS捕获物可以检测到荧光信号。培养20h后,初始染菌浓度为3SymboltB@10-1 cfu/25g以上,对增菌液直接检测和IMS捕获物检测都可以检测到荧光信号。初始污染浓度较低时,增菌6h后IMS-qPCR的检测灵敏度高于增菌液直接qPCR检测;IMS捕获物涂布显色培养基分离目标菌检测灵敏度高于增菌液直接涂布;CHROMagar STEC显色培养基分离STEC O26∶H11的检测灵敏度高于山梨醇麦康凯培养基(SMAC)。结论 IMS联合qPCR检测食品中的STEC O26∶H11具有特异性强、敏感度高、快速、易操作等特点,可以提高样品中STEC O26∶H11菌的检出率,适用于牛肉制品中STEC O26∶H11的快速检测。     

5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术

将5种致泻大肠埃希氏菌的毒力基因保守序列进行设计并合成了引物和探针,建立的多重实时荧光PCR4种试剂盒可以同时检测5种致泻大肠埃希氏菌。结果表明:4种试剂盒的12对毒力基因通过5种致泻大肠埃希氏菌的标准储备菌株均得到验证;并且12对毒力基因只对对应的致泻大肠埃希氏菌特异性起作用,对常见的食源性致病菌都无扩增曲线;escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因的检出限是10CFU/mL,aggR基因的检出限是10~2 CFU/mL,astA和pic基因的检出限是10~3 CFU/mL,而stx_2A、ipaH和stIb基因菌液浓度10CFU/mL时,均可观察到明显的"S"型扩增曲线,且线形较好;并且对抽查和委托检验的肉类、奶和动物腹泻物以及人工污染样品等40份样品进行检测,共检出11份阳性样本,与GB 4789.6—2016标准检测结果相一致,表明建立的4种试剂盒方法具有良好的实用性。     

同步增菌结合实时荧光聚合酶链式反应快速检测食品中5种致病菌

摘 要：目的 实现食品中5种致病菌的同步增菌,并结合实时荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）技术,建立快速检测的方法体系。方法 比较金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌5种目标菌分别在营养肉汤和缓冲蛋白胨水中的生长曲线;优化DNA模板提取的方法;采用实时荧光PCR技术及熔解曲线分析,建立5种致病菌的快速检测方法。结果 缓冲蛋白胨水可以作为5种目标菌的同步增菌液,增菌3 h后5种目标菌能被检出,最低检出的DNA浓度范围为10-3~10-4 ng/μL。经熔解曲线分析,5种目标菌的特征熔解Tm值范围为79.51~87.39℃。结论 本研究建立的5种致病菌快速检测方法,检测总时间大约为6 h,且方法灵敏度和特异性均能满足检测要求。     

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针, 合成基因片段绘制标准曲线, 在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后, 对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%; 基因组DNA检测敏感性为7.11×102 fg/μL; 纯培养物水平检测敏感性为1.0×102 CFU/mL; 重复性变异系数在0.10%~1.00%之间; 标准曲线相关系数r2为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法, 该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短, 仅为35 min的特点, 可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。     

3种方法检测食品中致泻大肠埃希氏菌检测能力验证结果分析

目的提高食品中致泻大肠埃希氏菌的检测能力,促进实验室检测能力的提高。方法参照GB4789.6-2016《食品微生物学致泻大肠埃希氏菌检验》方法进行检测,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统进行生化鉴定、血清学鉴定,对可疑菌落进行普通PCR确证试验。同时使用多重实时荧光PCR法以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析鉴定可疑菌落。结果国标法和多重实时荧光PCR法能准确鉴定出目标菌,MALDI-TOF-MS可以检测大肠埃希氏菌,但无法区分致泻大肠埃希氏菌和肠出血性大肠埃希氏菌。结论 3种方法各有优劣,同时使用,综合判断,能确保试验结果准确快速。     

qPCR快速定量检测泡结球甘蓝发酵过程中优势细菌的数量变化

目的:为快速准确定量检测泡菜发酵过程优势细菌的动态变化。方法:本实验采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)技术,以植物乳杆菌、芽孢杆菌属、葡萄球菌属和大肠埃希氏菌为目标菌,建立了一种快速定量检测泡菜样品中细菌数量的方法。结果:本方法标准曲线相关系数R2≥0.98、扩增效率90%~110%,加标回收率80%~100%,符合qPCR检测基本要求。结论:本实验建立的qPCR方法适用于泡菜中植物乳杆菌、芽孢杆菌属、葡萄球菌属和大肠埃希氏菌的快速定量检测。