大米镉结合蛋白的凝胶层析纯化及生化性质

目的研究大米镉结合蛋白(rice cadmum-binding protein,RCBP)的纯化及生化性质,探讨RCBP的形成机制。方法采用Sephedex G-75凝胶层析从乙醇沉淀的大米蛋白(Ethanol precipitation protein,EP)中纯化RCBP,SDS-PAGE鉴定RCBP的纯度及测定分子质量,氨基酸自动分析仪、FTIR分析RCBP的氨基酸组成及二级结构。结果凝胶层析纯化得到组分b(目标RCBP),组分b为纯度均一的RCBP,分子质量约为32 kDa。组分b中疏水性氨基酸占56.76%、芳香族氨基酸占19.41%,是一类富含疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的镉结合蛋白。组分b中N-H相对于C=O以反式构型存在,二级结构只含有β-折叠和β-转角。结论镉通过疏水氨基酸或芳香族氨基酸的特征基团与大米蛋白结合形成RCBP。     

大米镉结合蛋白的分离纯化及纯度鉴定

采用石墨炉原子吸收光谱法（graphite furnace atomic absorption spectrometry,GFAAS）测定不同品种、不同加工精度大米及大米4 种蛋白质中的镉含量。选用镉含量较高的大米为实验原料,采用Osborne分级法提取大米中的4 种蛋白质（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）,以及超滤、离子交换色谱从镉含量较高的大米蛋白中分离纯化出均一纯度的大米镉结合蛋白（rice Cd-binding protein,RCBP）,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）鉴定RCBP的纯度及测定分子质量。结果表明：籼米中镉含量高于糯米及粳米;随着加工精度的增加,同种大米中的镉含量依次降低。4 种大米蛋白中的镉含量分别为0.66、0.31、0.63、0.23 μg/g,清蛋白中镉含量最高。超滤分离大米清蛋白（rice albumin,RA）得到大米超滤清蛋白（rice ultrafiltration albumin,RUA）,离子交换色谱纯化RUA得到目标镉结合蛋白（组分c）,SDS-PAGE鉴定组分c为单一条带,分子质量为14 kD。     

采用微射流处理改变番茄籽分离蛋白的理化性质及结构

碱溶酸沉法所制备的番茄籽分离蛋白,其溶解性等功能性质较差。以番茄籽分离蛋白为原料,研究微射流均质对其功能性质及结构的影响。结果表明：微射流均质过程中番茄籽分离蛋白的结构变化与其功能性质的改变存在关联。微射流均质提高了番茄籽分离蛋白的溶解性、乳化性及乳化稳定性;均质后的番茄籽蛋白粒径更小,分布更均匀;暴露巯基和总巯基含量减少;分子内部疏水基团暴露,表面疏水性提高;蛋白晶体结构变化不大;蛋白质的二级结构发生了变化,α-螺旋、无规卷曲、β-转角均减少,而β-折叠增加。这些变化说明,微射流均质处理使蛋白分子发生了伸展或折叠,从而改变其功能性质。     

超声波对大豆分离蛋白结构及其形成谷氨酰胺转氨酶改性凝胶性质的影响

为探讨超声波对大豆分离蛋白（soybean protein isolate,SPI）结构及大豆分离蛋白形成谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase,TG）改性凝胶的影响,研究了超声波处理前后大豆分离蛋白平均粒径、溶解性、表面疏水性、二级结构、微观结构及凝胶特性的变化规律。结果表明：超声波处理使大豆分离蛋白平均粒径减小,溶解性增加,表面疏水性增强,α-螺旋含量降低,无规卷曲含量升高,β-折叠和β-转角无显著变化;超声波处理可以促进大豆分离蛋白形成结构均匀、致密的TG改性凝胶,最佳处理时间为60 min,此时凝胶强度为146.57 g,提高幅度达62.12%,持水性为94.27%,提高幅度为3.66%。相关性分析表明,大豆分离蛋白的溶解性以及其形成TG改性凝胶的凝胶强度、持水性与平均粒径有显著的负相关性。     

冻藏条件下魔芋葡甘聚糖降解产物对肌原纤维蛋白结构的影响

为了研究魔芋降解产物对肌原纤维蛋白冷冻保护的作用机制,以草鱼肌原纤维为研究对象,采用紫外光谱、傅里叶红外光谱和扫描电镜研究不同的魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGM）降解产物对冷冻贮藏草鱼肌原纤维蛋白结构的影响。结果表明：随着贮藏时间的延长,肌原纤维蛋白的最大吸收波长呈红移,主要由酪氨酸产生,不同的冷冻保护剂均不能保护酪氨酸的暴露。α-螺旋和β-折叠为草鱼肌原纤维蛋白主要的二级结构,随着贮藏时间的延长,α-螺旋结构所占比例上升,β-折叠结构所占比例下降,β-转角和无规卷曲的含量变化不大。辐照降解KGM和酶解KGM均对草鱼肌原纤维蛋白的二级结构有保护作用,稳定α-螺旋和β-折叠所占比例;而蔗糖-山梨糖醇促进草鱼肌原纤维蛋白中α-螺旋结构形成,不利于β-转角结构。显微观察的结果显示,辐照KGM样品和酶解的KGM样品可以延缓蛋白分子的聚集,延缓蛋白出现多孔状结构,而蔗糖-山梨糖醇样品冻藏过程保持片层结构。     

甘蔗原汁后混浊及其蛋白质组成特征

甘蔗原汁后混浊是指澄清甘蔗汁在贮存或商品流通期间发生成分变化,浊度增加或产生沉淀的现象。该研究通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、组合式质谱鉴定、氨基酸组分分析和傅立叶红外分析等方法,研究甘蔗原汁后混浊物的基本成分、蛋白质的分子质量大小、种类、氨基酸组成及二级结构。实验发现,甘蔗原汁后混浊物中主要成分是总糖,其含量达60.94%,其次是灰分和蛋白质,含量分别为19.52%和18.43%,酚类仅为0.62%。后混浊蛋白质分子质量分布在42 ku左右和小于20 ku,分别鉴定出12种和44种蛋白,其中丰度较高的几种蛋白分别为protein Z,PREDICTED：calmodulin-7 isoform X1,PREDICTED：calcium-dependent protein kinase 34 isoformX1和hypothetical protein SORBIDRAFT_01g014740。后混浊蛋白质和上清液蛋白质的氨基酸组成差异不大,但在二级结构上差异明显。后混浊蛋白质中除了无规卷曲结构远高于上清蛋白质外,α-螺旋和β-转角分别比上清蛋白质低33.43%和22.42%,而β-折叠差异不大。总的来说,分子质量大小低于42 ku、疏水值高、α-螺旋含量低和无规卷曲含量高的蛋白质更容易参与甘蔗原汁后混浊。     

紫薯花色苷-蛋白复合物的制备及结构表征

采用硫酸铵沉淀法制备紫薯花色苷-蛋白复合物,经二乙氨基乙基纤维素52和Sephadex G-75葡聚糖凝胶纯化得紫薯纯蛋白,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定紫薯蛋白及紫薯花色苷-蛋白复合物的分子质量,运用紫外、荧光、红外和圆二色谱多种光谱方法对紫薯蛋白及紫薯花色苷-蛋白复合物进行结构表征。结果表明：紫薯蛋白及花色苷-蛋白复合物的分子质量无明显差异,均存在4 种不同的分子质量分布：58、24、18 kD和14 kD。紫薯蛋白紫外最大吸收峰位于200 nm波长处,复合物的紫外光谱略有红移且吸收增强。紫薯蛋白荧光光谱的最大发射波长是340 nm,而复合物的荧光强度几乎完全猝灭。紫薯蛋白的红外光谱图具有酰胺带特征吸收,复合物的红外光谱峰形和吸收强度发生明显变化。圆二色谱图显示紫薯蛋白二级结构以β-折叠（43.6%）和无规卷曲（45.7%）为主,β-转角（10.6%）次之,而复合物以β-折叠（72.2%）为主,无规卷曲（27.8%）含量降低,β-转角消失。     

青稞和小麦醇溶蛋白和谷蛋白结构性质的比较研究

采用Osbron法分别提取青稞和小麦中的醇溶蛋白和谷蛋白,对这4 种蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析和红外光谱分析,并测定其表面疏水性、热稳定性、总巯基和二硫键含量。结果表明：醇溶蛋白在青稞蛋白质中的含量为16.96%,低于其在小麦蛋白质中的含量;谷蛋白在青稞蛋白质中的含量为47.83%,高于其在小麦蛋白质中的含量,但经SDSPAGE分析发现青稞中高分子质量谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS）含量远低于小麦中的。青稞醇溶蛋白和谷蛋白中的二硫键和总巯基含量均低于小麦中的。4 种蛋白的表面疏水性差异不大。青稞谷蛋白的热稳定性高于小麦谷蛋白,不利于其吸收水分和部分展开。红外光谱分析发现小麦醇溶蛋白和青稞醇溶蛋白的二级结构主要由β-转角和β-折叠组成,而小麦醇溶蛋白中的β-转角所占比例更高;青稞谷蛋白和小麦谷蛋白的二级结构主要以β-折叠为主。     

热处理对葵花分离蛋白结构特性的影响

研究了热处理对葵花分离蛋白结构性质的影响。将浓度8%(V/V)的葵花分离蛋白分散液(pH 7.0)分别于92,102,112℃条件下热处理20 min,以天然蛋白质为对照,分析热处理蛋白质的氨基酸组成、二级结构、分子柔性、粒径分布、表面形态的变化。结果表明,葵花分离蛋白经92,102℃热处理后α-螺旋结构显著增加,无规则卷曲降低;112℃热处理后β-折叠结构明显增加;92℃热处理后蛋白质分子柔性增强,之后随着温度升高,分子的柔性减弱。热处理后葵花分离蛋白表面粗糙、结构松散,蛋白质分子之间发生交联或聚集,粒径增大,但氨基酸组成随温度变化不显著。     

苦荞麦抗肿瘤蛋白的分离纯化及结构分析

本研究采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换色谱、Sephadex G-100凝胶过滤色谱和SephacrylS-200凝胶过滤色谱对苦荞麦水溶性蛋白质(TBWSP)逐步分离纯化,并结合细胞实验,筛选出苦荞麦水溶性蛋白质中体外抗肿瘤活性的有效组分TBWSP31。体外抗肿瘤活性实验表明,TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37细胞有明显的增殖抑制作用,并且存在时间效应和剂量效应。SDS-PAGE表明,TBWSP31为单一组分,其亚基的相对分子质量为57000。CD分析表明,TBWSP31的α-螺旋的含量为33.9%,β-折叠的含量为22.8%,β-转角的含量为11.3%,无规卷曲的含量为32.0%。     

基于红外光谱分析热处理对牛乳蛋白质二级结构的影响

运用傅里叶变换红外光谱技术对乳蛋白及其酰胺Ⅰ带进行解析,进一步用红外解谱法对其二级结构进行表征。以原料乳为对照,研究65℃/30 min(低温长时巴氏杀菌)、80℃/15 s(高温短时巴氏杀菌)、95℃/5 min(酸乳热处理)、137℃/5 s(超高温灭菌)等不同热处理条件对乳中蛋白质二级结构的影响。结果表明,热处理会导致乳蛋白间发生相互作用,乳蛋白原空间结构受到破坏,导致分子内氢键被破坏。不同热处理程度的乳蛋白酰胺Ⅰ带均向低波数方向发生了不同程度的红移,表明乳蛋白变性过程中疏水氨基酸残基暴露形成分子间氢键。同时热处理后乳蛋白各二级结构比例发生明显改变。α-螺旋含量显著降低(P0.05),无规卷曲含量显著升高(P0.05),β-转角及β-折叠含量在加热过程均呈先增加后减少变化趋势,表明热处理程度增强导致部分有序结构向无规卷曲结构转化,蛋白质热变性后会发生热聚集现象,且β-折叠、β-转角结构在热聚集体的形成过程中具有重要作用。     

热处理对蘑菇多酚氧化酶活性及结构的影响

以蘑菇多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）为原料,研究不同温度热处理对PPO活性的影响。选取不同温度（50、55、60、65 ℃）处理10 min后的PPO样液,应用圆二色光谱（circular dichroism,CD）和荧光光谱研究热处理对PPO二级结构和三级结构的影响。结果表明：在各温度下进行热处理的PPO活性均随着处理时间的延长逐渐降低,热处理温度越高抑制效果越明显;CD光谱表明热处理后的PPO二级结构发生了改变,主要表现在α-螺旋含量下降,β-折叠含量升高,而β-转角及无规卷曲含量则没有太大的变化;荧光光谱表明热处理后的PPO三级结构发生改变,表现在最大荧光发射峰发生了明显红移。     

热处理对大豆油脂体乳液特性的影响

以大豆油脂体乳液为研究对象,利用动态表面张力测量、动态激光散射、圆二色光谱、共聚焦等技术研究大豆油脂体在不同温度（30、50、70 、90 ℃）条件下乳液的物理稳定性、氧化稳定性及油脂体表面蛋白二级结构的变化,考察了温度对乳液界面张力、界面特性的影响。结果表明：热处理降低了大豆油脂体乳液表面电荷和界面张力,改变了界面强度;油脂体表面蛋白的二级结构α-螺旋含量从（17.71±0.01）%下降到（15.3±0.03）%,无规卷曲含量从（29.96±0.01）%下降到（27.3±0.06）%,β-转角含量从（22.34±0.05）%下降到（21.2±0.03）%,β-折叠含量从（29.89±0.06）%增加到（36.1±0.02）%,热处理改变了维持油脂体表面蛋白二级结构的作用力,影响二级结构含量变化,表现出不同的界面特性;4 个温度热处理没有明显促进油体的絮凝;30 ℃和50 ℃热处理的乳液,油脂氧化的氢过氧化物相对较少,表明热处理改变了大豆油脂体乳液的界面特性,进而影响油脂体乳液的物理稳定性和氧化稳定性。     

干热处理对米糠蛋白结构与功能特性的影响

对干热处理后米糠蛋白的结构及功能特性变化进行探讨,结果表明：90 ℃干热处理下米糠蛋白组分发生明显的热变性,米糠蛋白的β-折叠结构含量有较大程度降低,并主要转变为无规卷曲结构和β-转角结构。随着干热处理温度的升高,α-螺旋结构含量逐渐增大,无规卷曲结构和β-转角结构含量并未表现出明显的线性变化趋势。干热处理条件下无序结构的增多促进了米糠蛋白的水合作用,使米糠蛋白溶解性增加,而随着干热处理温度升高至100 ℃,米糠蛋白的溶解度有所降低;无序结构增多使米糠蛋白整体柔性增强,随着干热处理温度的升高,米糠蛋白的乳化性呈现先减小后增大的变化趋势,在100 ℃干热处理下米糠蛋白乳化性达到最大值45.56 m2/g,而米糠蛋白的乳化稳定性亦有所增加;米糠蛋白起泡性随干热处理温度的升高呈现先增大后减小的变化趋势,干热处理温度80 ℃时米糠蛋白起泡性达到最大值为87.36%,米糠蛋白的泡沫稳定性随干热处理温度升高逐渐降低。     

抗莠去津抗体基因构建及蛋白结构模拟

构建抗莠去津单链抗体基因,采用DNAStar软件对单链抗体基因进行氨基酸序列推导,用生物信息学在线网站预测莠去津单链抗体基本特性及二、三级结构。结果表明,抗莠去津单链抗体基因全长744 bp,对应248 个氨基酸,单链抗体相对分子质量约为26 061.9,等电点预测值7.81,为碱性蛋白质;二级结构中α-螺旋17 处,延伸链85 处,β-转角19 处,无规卷曲127 处;三级结构建模显示,重链和轻链的6 个环区共同组成了抗体的抗原结合区,符合单链抗体的结构特点,具有抗原结合位点的空间构象。该研究为抗莠去津单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究奠定了基础。     

韭菜β-木糖苷酶的分离纯化与部分性质研究

新鲜韭菜经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、羧甲基离子交换层析(carboxymethyl-sephar ose,CMSepharose)再通过Su perdex-200凝胶过滤层析,从而获得电泳纯的β-木糖苷酶。该酶的比活力达到18.25 U/mg,纯化倍数为12.59,回收率为1.83%,分子质量为123.02 k D,亚基分子质量为61.51 k D。通过对β-木糖苷酶的酶学性质研究得到最适温度为65℃,最适p H值为4。该酶在25~55℃及p H 3.0~5.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其米氏常数(K_m)值为0.28 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和Ag+对该酶具有抑制作用,Mn~(2+)和Co~(2+)对该酶具有一定的激活作用。