应用PCR快速检测食品中沙门氏杆菌方法的研究

本研究利用沙门氏杆菌属特异的inv A基因序列，设计一对特异性的引物，通过PCR反应来检测多种样品中的沙门氏杆菌；反应的特异性和敏感性以及反应的最适条件等试验的结果显示：此PCR方法检测沙门氏菌属的特异性为100％：样品中活菌的检测限为1．43CFU／10g：反应的最佳退火温度是65℃；最适模板浓度范围在10^4～10^8copies／ml。本方法与传统的沙门氏杆菌检测方法以及最近报道的相关方法比较，具有简单、快速、特异性好和敏感性高、经济等特点，并可满足大批样品沙门氏杆菌筛选检测的要求。     

食品中沙门菌PCR检测方法的建立

为建立食品中快速检测沙门菌的PCR方法。选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,选择最适Mg 浓度和退火温度,建立最适PCR反应体系,用2%琼脂糖,5μl反应产物(包括EB),100V,40min进行电泳,显像。用该引物对已经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌进行特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件的研究。Mg 浓度和退火温度对该反应体系的影响较小,稳定性较好;经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌验证了该检验方法具有很好的特异性;该检测方法可以在19h内检出含有沙门菌102CFUg的食品(火腿肠、鸡蛋、散装肉馅)。与传统方法比较,该方法快速、敏感、特异,能在较短的时间内对大量样品同时进行检测,适用于食品中沙门菌的快速、敏感、特异检测。     

PCR技术检测动物源性食品中沙门菌的应用研究

为快速准确检测动物源性食品中的沙门菌,将建立并优化的沙门菌PCR检测试剂盒应用于动物源性食品的检测,并于国标法进行了比较.对上海地区238份鸡蛋、685份原料牛奶、283份猪肉、314份牛肉和58份虾仁样品的沙门菌检测表明,PCR法的敏感性和特异性均为100%,与国标法的符合率亦为100%,且检测时间仅为2 d,较国标法大为缩短.该方法可用于动物源性食品中沙门菌的检测,并具有快速、特异、敏感等优点。     

SYBR GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR GreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法，根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物，进行SYBR GreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测；沙门菌不同群菌株做重现性检测；将沙门菌菌株稀释成不同梯度，做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性，沙门菌属5个群菌株均为阳性：而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高，检测低限为19CFU／ml。该方法特异性强，重现性好，敏感性高，可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过熔解曲线可知其熔点值约为80，4℃，而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

3种常见食源性致病菌多重重组酶聚合酶扩增检测方法研究

目的建立了食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌多重重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）快速检测方法。方法选择沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因和蜡样芽孢杆菌16S RNA序列为目标基因进行扩增,建立并优化多重RPA扩增体系和扩增条件;评价反应体系的特异性和灵敏度,并对人工污染食品样品和实际样品进行检测。结果多重RPA反应体系能够在20 min完成三种目标基因的扩增,特异性强;对沙门菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的灵敏度分别为2.70×105、1.30×105、1.44×104 CFU/mL;能够用于人工污染样品和实际样品的检测。结论本研究建立的多重RPA等温扩增方法特异性强,操作快速、简单,为食源性致病菌的快速检测提供新方向     

SYBR~ GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBRGreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYBRRGreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高,检测低限为19CFUml。该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术,利用SYBRGreenI染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBRGreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

双重荧光定量PCR检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

目的建立双重荧光定量PCR方法,快速检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌。方法通过设计特异性引物和探针,扩增沙门菌的fimY基因和单核细胞增生李斯特菌的hly基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外7株肠道致病菌评价检测体系的特异性;建立了沙门菌和单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了同时检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌的双重荧光定量PCR方法,从DNA提取到检测完毕仅需2.5 h。检测两种病原菌的灵敏度分别为11和12.8 copies/μl,特异性为100%,符合率为93.3%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中很有应用前景。     

SYBR(R) GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法,根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物,进行SYB(R) Green Ⅰ实时PCR检测.以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测;沙门菌不同群菌株做重现性检测;将沙门菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.该方法有较好的特异性、重现性,沙门菌属5个群菌株均为阳性,而其它非同源菌株均为阴性.该方法灵敏度较高,检测低限为19 CFU/ml.该方法特异性强,重现性好,敏感性高,可以快速、准确检测食品中沙门菌.应用实时PCR技术,利用SYBR(R) Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门菌中inv A基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过熔解曲线可知其熔点值约为80.4℃,而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号.SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法.     

多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

应用LAMP方法检测动物源性食品中沙门菌

目的运用两种方法对动物源性食品中沙门菌进行检测,找出一种更加快速、敏感、特异、简便的检验方法。方法采集60份市售的禽、畜等生肉及60份奶制品,分别采用LAMP方法和国家标准方法GB/T4789.4—2008对沙门菌进行分离与鉴定。结果 120份采集样品中,LAMP方法检出2例,阳性率1.67%;国家标准方法检出1例,阳性率0.83%。LAMP方法的符合率为99.2%,敏感性为100%,特异性为99.2%。结论 LAMP检测法快速、特异、简便,该方法与国标法的阳性率差异无显著性。     

传染性支气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立

建立特异、敏感、快速的传染性支气管炎病毒(IBV)实时荧光定量PCR检测方法。针对IBV基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性的探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测。结果表明所建立的IBV实时荧光定量PCR检测方法,引物和探针特异性良好,组间组内重复性良好,检出IBV DNA最小拷贝数为5拷贝。因此,本研究建立IBV特异、敏感、快速的实时荧光PCR检测方法,为IBV的诊断奠定基础。     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猫源性成分

根据猫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原酶亚基1（ND1）基因中的保守序列设计猫特异性引物和TaqMan探针,建立食品中猫源性成分的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。通过实时荧光PCR反复验证,结果表明,引物和TaqMan探针对猫源性成分的特异性良好,检测灵敏度可达1 pg,适用于食品中猫源性成分的快速鉴定。通过对随机抽取的市售肉制品的检测,尚未发现掺有猫源性成分的行为。     

基于cgcA基因实时荧光PCR快速检测穆汀斯克罗诺杆菌的研究

为实现奶粉中常见污染菌穆汀斯克罗诺杆菌的快速检测与控制,本文根据cgcA基因序列设计出特异性探针和引物,建立了运用实时荧光定量PCR法检测穆汀斯克罗诺杆菌的反应体系和反应条件,并对该法的特异性、灵敏度、稳定性进行评价,并进行人工染菌样品检测实验。特异性结果表明,对穆汀斯克罗诺杆菌的荧光PCR检测结果的特异性为100%;灵敏度结果表明,穆汀斯克罗诺杆菌检出限在440 cfu/m L;稳定性结果表明,穆汀斯克罗诺杆菌组内实验CV在0.48~0.69%之间波动,而组间实验CV在0.69~0.73%之间波动;人工染菌样品试验表明,在增菌6 h后能检出阳性。本研究所建立的实时荧光定量PCR法特异性好、灵敏度高、稳定性强,有望成为快速检测食品中穆汀斯克罗诺杆菌污染的新方法,具有很好的研究价值和应用前景。     

A real-time PCR assay for the detection of Salmonella in a wide variety of food and food-animal matricest

Conventional culture methods have traditionally been considered the "gold standards" for the isolation and identification of foodborne pathogens. However, culture methods are labor-intensive and time-consuming. We have developed a real-time PCR assay for the detection of Salmonella in a variety of food and food-animal matrices. The real-time PCR assay incorporates both primers and hybridization probes based on the sequence of the Salmonella invA gene and uses fluorescent resonance energy transfer technology to ensure highly sensitive and specific results. This method correctly classified 51 laboratory isolates of Salmonella and 28 non-Salmonella strains. The method was also validated with a large number of field samples that consisted of porcine feces and cecal contents, pork carcasses, bovine feces and beef carcasses, poultry cecal contents and carcasses, equine feces, animal feeds, and various food products. The samples (3388) were preenriched in buffered peptone water and then selectively enriched in tetrathionate and Rappaport-Vassiliadis broths. Aliquots of the selective enrichment broths were combined for DNA extraction and analysis by the real-time PCR assay. When compared with the culture method, the diagnostic sensitivity of the PCR assay for the various matrices ranged from 97.1 to 100.0%, and the diagnostic specificity ranged from 91.3 to 100.0%. Kappa values ranged from 0.87 to 1.00, indicating excellent agreement of the real-time PCR assay to the culture method. The reduction in time and labor makes this highly sensitive and specific real-time PCR assay an excellent alternative to conventional culture methods for surveillance and research studies to improve food safety.     

高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌

为建立一种快速鉴定副溶血性弧茵的HRM（高分辨率熔解曲线）real-timePCR法,以toxR为靶基因,结合特异性引物,通过优化反应体系及条件,进行特异性、敏感性及重复性评价,并初步应用于90份送检的鲜活海产品样本的检测。特异性试睑表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,Tm值为76．64±0．57℃;而与创伤弧菌、霍乱弧茵、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明,该方法最少可检测toxR重组质粒的浓度为3．50×102copies／mL。重复性试验表明,同一样品于试验内及试验问的平均Tm值分别为76．53±0．35℃和76．74±0．52℃,变异系数分别为0．56±0．42％和1．11±0．73％。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14．44%高至18．89％。本研究所建立的副溶血性弧菌HRMreal-ILrnePCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能应用于食品样本的检测,具有很好的研究价值和应用前景。     

Rapid, specific detection of Salmonella Enteritidis in pooled eggs by real-time PCR

An assay was developed for the specific detection of Salmonella Enteritidis in eggs with the use of an application of the fluorogenic 5' nuclease assay (TaqMan). In this assay, a segment of the gene sefA specific to Salmonella group D strains such as Salmonella Enteritidis was used. The amplification of the target gene products was monitored in real-time by incorporating a fluorescent dye-labeled gene-specific probe in the PCR reaction. This method correctly detected and distinguished Salmonella Enteritidis from nearly 50 of non-group D Salmonella and other non-Salmonella strains. Detection of the sefA gene was linear for DNA extracted from approximately 10(2) to 10(9) CFU/ml in phosphate-buffered saline and 10(3) to 10(8) CFU/ml in raw egg. In two trials, when applied to detection of Salmonella Enteritidis in homogenized egg pools and compared with conventional culture methods, the newly developed PCR method yielded a 100% correlation with results obtained by a conventional culture method. However, the PCR method required only 2 days, compared to the 5 days required by the culture method. The sensitivity of this assay was approximately less than 1 CFU/600 g of egg pool. The real-time PCR assay proved to be a rapid, highly sensitive test for detection and quantification of low concentrations of Salmonella Enteritidis in egg samples.     

阪崎肠杆菌zpx基因的分子信标一实时PCR技术研究

目的建立分子信标-实时PCR技术检测婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速方法。方法在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA,建立阪崎肠杆菌zpx基因分子信标-实时PCR技术快速检测方法。结果检测方法特异性强,无非特异性扩增;分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为180fg/PCR反应体系,纯阪崎肠杆菌菌液的检出限为102 CFU/ml,无交叉反应;以此反应体系检测23份样品,其中2份为阳性,余未检出,与传统检测方法结果一致。结论分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

绿色魏斯氏菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

以rpoA基因为靶基因,建立绿色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）快速检测方法。针对rpoA基因设计特异性引物,建立绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测体系,通过特异性、灵敏度和重复性实验评价体系的检测效果,同时与常规PCR方法进行比较。结果表明：实时荧光定量PCR方法能够特异性检出绿色魏斯氏菌,对基因组DNA的检测灵敏度达到2.667×10－3 pg/μL,对纯培养物和模拟污染牛肉样品直接检测的灵敏度分别为30 CFU/mL和0.8 CFU/g;与常规PCR相比,实时荧光定量PCR检测的灵敏度是其1 000 倍;不同浓度样品独立重复实验循环阈值的标准差均小于1,变异系数在0.02%～1.28%之间。本研究所建立的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能够进行准确的定量检测,是快速检测绿色魏斯氏菌的有效手段。     

食源性单增李斯特菌的实时定量PCR检测

根据GenBank数据库单增李斯特菌的O基因序列(AF253320)设计引物,建立单增李斯特菌实时荧光定量PCR检测方法。标准曲线的相关系数为0.996,检出底限约8个细菌/反应,而常规PCR检出底限约60个细菌/反应。比较常规PCR和实时荧光定量PCR对人工污染样品检测,发现实时定量PCR也具有较高的灵敏度;对40份牛奶和40份火腿样品进行检测,阳性率分别为12.5%和10%,与传统细菌分离检测结果完全相符。因此,实时定量PCR检测单增李斯特菌具有快速、灵敏的优点,适宜于食品中单增李斯特菌污染的调查及监测。