自然发酵腐乳中芽孢杆菌的分离与鉴定

从自然发酵腐乳中筛选芽孢杆菌并研究其作用。根据菌株产蛋白酶能力大小,对自然发酵腐乳中细菌进行分离纯化获得四株芽孢杆菌,经纯化培养后观察其个体形态和菌落形态,利用Biolog微生物自动鉴定系统和16S r DNA序列分析对其精确鉴定。结果显示四株菌株分别为:一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B),两株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus B),一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens B)。     

婴幼儿配方奶粉中的菌相分析

从市场上随机抽取不同生产厂家的婴幼儿奶粉,通过菌落总数测定,单菌落的分离,利用细菌通用引物27f/1492r对不同菌株进行16S rDNA片段扩增、测序,建立菌株的系统发育树进行分析。结果表明,婴幼儿配方奶粉中主要有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium),其中,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为优势菌种。说明婴幼儿配方奶粉中存在的微生物主要为芽孢杆菌。     

高产蛋白酶细菌的分离筛选及其种类鉴定

从广东、河北、辽宁、湖南、江苏等省份采集土壤样品9个,采用稀释涂布的方法共分离到细菌菌株44株,利用平板透明圈法对44株细菌菌株产蛋白酶能力进行初步筛选,16株菌株出现了明显的透明圈,菌株G1-b、GD-2-2、HX-B-1的蛋白酶活性最强,透明圈/菌落直径比(HC)在3.5以上;比色法测定产酶活性强的3株菌株的蛋白酶酶活力,GD-2-2菌株的产酶能力最强,酶活力达到447.6U/mL。通过对细菌GD-2-2菌株形态学观察、生理生化实验,结合相关文献,初步鉴定菌株GD-2-2属于芽孢杆菌属。对菌株GD-2-2的 16S rDNA序列分析表明,该菌株序列与细菌Bacillus licheniformis strain YB915 (GQ996726.1)的16S rDNA序列同源性达100%,综合形态学观察和生理生化实验结果,鉴定GD-2-2菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。     

酿造环境中细菌的筛选及代谢产物研究

研究酿造环境中细菌组成,并进一步筛选出10株产风味物质明显的细菌,通过菌种形态特征、生理生化鉴定、16s rDNA测序分析,1#菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);2#、5#、6#、8#、9#菌株为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans);3#菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);4#菌株为多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa);7#、10#菌株为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。分析这10株细菌的固态培养代谢产物,能够产生多种芝麻香典型呈味物质。     

糙米发芽过程中优势细菌分离鉴定

研究糙米在发芽过程中细菌总数变化,分离、纯化、鉴定发芽糙米中优势细菌;以营养琼脂为培养基,采用十倍稀释法分离、纯化发芽糙米中优势细菌,并采用16S rDNA测序与基因比对方法鉴定发芽糙米优势细菌。发芽过程中,细菌总数先减少再增加,在发芽完成时,细菌总数达7.08×108 cfu/g;分离到1株优势细菌,该细菌菌株与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)16S rDNA序列相似性为99.5%;所以,发芽糙米存在食品安全隐患,必须控制糙米发芽过程中微生物。     

纤维素分解菌BSX5的分离、鉴定及产酶条件

利用透明圈法从袋装降解的笋干中分离到一株分解纤维素的细菌菌株. 该菌株呈长杆状、革兰氏染色为阳性、产芽孢,命名为BSX5.其生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析,发现该菌株与Bacillus subtilis的同源性为99%,系统发育树分析与Bacillus subtilis遗传关系最近,确定该菌株为Bacillus subtilis. 采用以3,5-二硝基水杨酸（DNS）为显色剂、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为底物,测定不同培养条件下BSX5菌株的酶活力,结果最适产酶时间为8-12 h,最适产酶温度为50 ℃,最适产酶pH值为5.5～6.5.     

兼香型白云边酒高温堆积过程主要细菌的分子鉴定

采用曲汁培养基和牛肉膏蛋白胨培养基从白云边酒厂堆积酒醅中分离细菌,获得了6株有明显特征差异的细菌。用PCR技术对其进行了16S rDNA序列扩增、同源对比和系统发育分析,结果表明:6株分离菌株中W-1、W-3、G-4、G-1、DJ-1C菌株分别与芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus velezensis、Bacillus licheniformis、Bacillus sporothermodurans有较高的相似性,而菌株4J与5种芽孢杆菌Bacillus vireti、Bacillus bataviensis、Bacillus drentensis、Bacillus soli、Bacillus novalis的标准菌株既有一定的相似性,也有一定的遗传距离,可能是一个不同于已知菌的芽孢杆菌新种。     

天祝放牧牦牛生活环境土壤中一株产凝乳酶细菌的分离与鉴定

筛选高产凝乳酶细菌,并对其进行鉴定和产凝乳酶活力测定。利用酪蛋白培养基从天祝放牧牦牛生活环境土壤中筛选高产凝乳酶细菌,利用形态观察、生理生化检测、16S rDNA 序列分析对其进行鉴定,并采用Arima法和福林法分别测定凝乳酶活力和蛋白水解活力。获得18 株产凝乳酶细菌,其中菌株D3.11 产凝乳酶活力相对最高,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),其在麸皮培养基中发酵72 h 产凝乳酶活力高达89.56 SU/ml,蛋白水解力为21.27U/ml。菌株D3.11 是一株高产凝乳酶细菌,可作为候选菌株进行进一步研究。     

菌株BS-3的鉴定及其真菌抑制活性的初步研究

从土壤中分离得到一株对多种植物病原真菌具有抑制作用的菌株,将其命名为BS-3。该菌株对水稻纹枯病、稻瘟病、苦瓜枯萎病等病原真菌均有较强抑制作用。通过对菌株BS-3的16S rDNA的序列测定和同源性比对,发现它与Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens等的16S rDNA有高达100%的同源性,结合形态和生理生化鉴定指标,将其鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。选用受其抑制作用较明显的水稻纹枯病病原真菌瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）作为指示菌,牛津杯法检测BS-3菌株发酵产物的抑菌活性。结果表明BS-3菌株的发酵上清液滤液、硫酸铵处理离心沉淀对水稻纹枯病菌有较强抑菌活性。此外,该抗真菌物质具有较强热稳定性。     

五粮浓香型白酒窖房和曲房空气细菌相关性的初步研究

从宜宾华夏酒业窖房和曲房空气中分离得到44株细菌,对所得菌株进行了16S rDNA基因系统发育及部分酿造特性分析。窖房和曲房空气的细菌在属和种一级的相似性分别为40.0%和36.4%,且均以Bacillus cereus、Bacillus anthracis细菌为优势种,表明2个细菌群落具有一定的相似性。分离自窖房空气的菌株有20株（占95.2%）耐受7%的无水乙醇,2株菌耐受pH4.5,且分别有2株、9株能够产纤维素酶和淀粉酶;分离自曲房空气的菌株均不耐受7%的乙醇和pH4.5,产纤维素酶和淀粉酶的菌株分别有6株、3株。结果表明,经过长期的酿酒生产,曲房和窖房空气中均形成了较为稳定的细菌区系,其菌落组成与酿酒生产存在较为密切的相关性。在生产中,2个细菌群落之间存在广泛的交流。     

强化曲中毕赤酵母与地衣芽孢杆菌的相互作用研究

以实验室分离得到的毕赤酵母FBKL2.0008与产酱香风味的细菌FBKL1.0199作为主要菌种,用于强化麦曲的制备。设置了5个接种比例,30℃发酵14 d后,确定了最佳的接种比例为地衣芽孢杆菌∶毕赤酵母=1∶10。监测强化曲发酵过程中微生物生物量,酸性蛋白酶活,淀粉酶活变化情况,可知毕赤酵母的加入对地衣芽孢杆菌的生长与代谢产物的生成情况没有明显影响。强化麦曲风味物质中吡嗪类物质相对百分含量为19.286%,其中四甲基吡嗪相对百分含量为16.365%。     

大曲中产酱香芽孢杆菌的筛选及其代谢产香探析

对茅台酒生产各环节所采集的28个样品进行了初步分析,从高温大曲制作过程的不同环节筛选出芽孢杆菌104株,用麦曲模仿升温发酵筛选产香的菌株,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等,其中产酱香优良的菌株25株,分为多种香味,与不产香型的细菌对比,产酱香的25株均能产生二乙酰、乙偶姻、蛋白酶、淀粉酶等,结合茅台的生产流程分析了其产香的可能机制,得到结论：芽孢杆菌在大曲发酵过程中产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶类和代谢物质,进而在高温、偏酸环境下通过美拉德反应产生吡嗪等多种茅台酒特征香味物质。     

高温大曲曲房空气中可培养细菌的分离鉴定及产酶特性

以高温大曲曲房空气中可培养细菌为研究对象,对其进行分离鉴定及产酶特性研究;将得到的优势功能细菌进行高粱汁液态发酵,利用气相色谱—质谱联用法分析其代谢产物。结果表明：从高温大曲曲房空气中共分离出8种菌株,分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、Pedobacter suwonensis、血红鞘氨醇单孢菌（Sphingomonas sanguinis）、Massilia sp.、Delftia sp.和 Sphingobacterium sp.;经产酶试验筛选得到3株优势功能菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）,均具有纤维素分解能力、淀粉和蛋白水解能力;3株菌的生长曲线表明液体培养4 h达到对数生长期,在高粱汁液态发酵48 h后,优势代谢产物为3-羟基-2-丁酮,且四甲基吡嗪含量也较高,并代谢产生少量高级醇、酚类、酯类等芳香物质。     

茅台大曲中3株芽孢杆菌代谢产物的比对分析

从茅台酒生产用大曲中分离纯化得到3株芽孢杆菌,分别是地衣芽孢杆菌MTDB-01、地衣芽孢杆菌MTDB-02和枯草芽孢杆菌MTDB-03。在制曲工艺条件下,对3株芽孢杆菌分别进行纯种固态发酵,分析比对其代谢产物。结果表明,其共同的代谢产物为:3-羟基-2-丁酮、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、呋喃扭尔、异戊酸、2-甲基-2-丁烯酸、2,3-丁二醇、β-苯乙醇和苯乙酸。初步明确这3株芽孢杆菌在茅台大曲生产过程中对茅台大曲风味的贡献。     

浓香型和酱香型大曲微生物多样性分析

大曲是中国白酒酿造过程中的糖化发酵剂,具有自然接种的特点。为探究同一酒厂浓香型和酱香型大曲微生物群落组成,分别采用传统培养和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳法（PCR-DGGE）对其微生物进行分析鉴定。传统培养法共分离鉴定出198株菌,其中浓香型大曲中24种,酱香型大曲12种。两种大曲中地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）数量占绝对优势,在浓香型大曲中优势真菌为谢瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri ）和米曲霉（Aspergillus oryzae）,而在酱香型大曲中,以伞状毛霉（Lichtheimia corymbifera）和多变拟青霉（Paecilomyces variotii ）居多;通过PCR-DGGE共鉴定出14种菌,两种大曲中葡萄球菌（Staphylococcus）、高温放线菌（Thermoactinomyces）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）为优势菌。     

用Biolog微生物自动分析系统鉴定大曲中地衣芽孢杆菌的研究

从大曲中分离到一株细菌,初步鉴定为地衣芽孢杆菌,利用Biolog微生物自动分析系统对它做了进一步的鉴定,确定其为地衣芽孢杆菌.     

Cultivable bacterial diversity and amylase production in three typical Daqus of Chinese spirits

Both culture‐dependent method and molecular technique were firstly used to simultaneously investigate the cultivable bacterial diversity and amylase production in three typical Daqus of Chinese spirits. The results showed that both cultivable bacterial diversity and amylase production were obviously different. The species of nine bacteria from Deshan, nine from Baisha and six from Wuling Daqus were identified. The total bacterial strains of 17, 15 and 14, and 9, 16 and 10 could produce α‐amylase and glucoamylase, respectively, from the Daqus, and the enzyme yields were different. Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens not only were dominant bacteria in the Daqus, but also possessed high activities of α‐amylase and glucoamylase. By comparison, Bacillus cereus and Bacillus oleronius were found to be another predominant bacterial species and good producers of α‐amylase and glucoamylase in Deshan and Wuling Daqus, respectively.     

偏高温大曲发酵过程中芽孢杆菌的演替

采用经典微生物学方法和16S rRNA基因系统发育分析的方法,对偏高温大曲发酵过程中的芽孢杆菌类群及其演替情况进行了分析。结果表明,在偏高温大曲发酵过程中,芽孢杆菌数量从拌料的6.0×105个/g曲快速上升到最大值3.2×107个/g曲（第一次翻曲,4 d）,最后降低到1.1×106个/g曲;芽孢杆菌类群从最初的3种增加到10种后减少至第一次翻曲时（4 d）的9种,随后多样性持续下降,到收曲时仅检测到6种。同时发现,在整个发酵过程中Bacillus licheniformis为绝对优势种,在整个发酵环节中均存在。Bacillus产芽孢的特性保证了其种群的延续性。     

丝状真菌改善强化曲品质的研究

将几株课题组保存的丝状真菌进行糖化酶活力检测,挑选出1株高产糖化酶的丝状真菌分枝犁头霉FBKL3.0009。对丝状真菌FBKL3.0009、毕赤酵母FBKL2.0008与地衣芽孢杆菌FBKL1.0199进行不同接种比例的混种固态发酵实验,研究丝状真菌与混培养体系中酵母菌、地衣芽孢杆菌的互相作用。结果表明,丝状真菌的添加对细菌与酵母的生长影响不大,混合发酵体系中丝状真菌的生长越旺盛,糖化酶的活力也就越高,还原糖含量也会随之增加。对培养结束后的麦曲进行理化指标检测可知,与不添加丝状真菌发酵的麦曲相比,糖化力得到提高。对强化曲进行GC-MS风味物质分析,丝状真菌的添加对吡嗪类物质产生有抑制作用。     

高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的筛选及其对酱香型白酒堆积过程的影响

为提高和稳定白酒中四甲基吡嗪含量,本研究从酱香大曲样品中分离出13株芽孢杆菌,通过蛋白酶透明圈试验初筛,选出5株产蛋白酶优良菌株。经过液态发酵试验筛选出一株高产四甲基吡嗪的功能菌,其发酵液中的四甲基吡嗪含量为12.22 mg/L,鉴定为地衣芽孢杆菌GTBL-168。将该菌株的种子培养液按0%、3%、5%和7%（v/w）接种到酱香型白酒堆积培养中与传统大曲协同发酵,堆积糟醅中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量均有提高,其中接种量为7%时增量最大,四甲基吡嗪产量比对照组提高24.88%;理化指标总体变化较明显,氨基氮和总酸有所增加;地衣芽孢杆菌GTBL-168的添加对堆积糟醅的菌群结构影响不大,随着接种量的增加糟醅中芽孢杆菌属等各优势菌属丰度也随之增加。为功能菌在堆积过程中的应用研究奠定了基础。