四川浓香型大曲生产中酵母菌、芽孢杆菌与工艺指标的关联性分析

研究四川浓香型白酒制曲过程中酵母菌、芽孢杆菌类群以及工艺指标(理化因子和质量指标)的动态变化,分析大曲中酵母菌和芽孢杆菌多样性及其与工艺指标的关系。根据QB/T 42572011《酿酒大曲通用分析方法》,监测制曲过程中的工艺指标,同时采用纯培养技术对11个样品中的酵母菌和芽孢杆菌进行选择性分离。纯培养获得的194株酵母菌,归属于子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的9个属,其中7个属都集中在酵母菌目(Saccharomycetales);148株芽孢杆菌被鉴定为8个种,其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为优势菌。另外,研究也验证了四川浓香型大曲在生产周期第90~180天为最佳使用期的生产经验,随着贮存期的继续延长,大曲品质出现大幅下降。冗余分析显示,温度、水分、酸度和淀粉含量与两大微生物类群以负相关为主,3种酵母菌(Kazachstania exigua、Candida tropicalis和Wickerhamomyces anomalus)和3种芽孢杆菌(B.subtilis、B.horneckiae和B.megaterium)是影响大曲质量的关键微生物类群。四川浓香型大曲生产过程中具有丰富的酵母菌与芽孢杆菌多样性且发生动态变化,它们既受到制曲理化因子的调控,也影响大曲品质。     

酱香型大曲的理化指标、水解酶系、微生物产酶的关系研究

酱香型大曲是典型的高温大曲,本文主要对酱香型大曲的理化指标以及水解酶系的种类和酶活力进行测定。研究发现,酱香型大曲的理化指标符合地方标准DB 52/T 871的规定;酱香型大曲中水解酶系主要为蛋白酶、淀粉酶和果胶酶。结合酱香大曲的水解酶系实验结果和原料小麦的成分,对已从酱香型大曲分离鉴定的19株细菌和17株霉菌进行产酶实验,测定其产酸性蛋白酶、中性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶和脂肪酶的能力。研究发现,水解酶系能够部分反映出曲中微生物的种类和数量;甲基营养型芽孢杆菌、黄曲霉和阿姆斯特丹散囊菌对酱香型大曲水解酶系贡献比较突出。将功能微生物制作成酶制剂,可用于提高酱香大曲的品质,为优化制曲工艺和强化大曲的制备提供理论依据。     

浓香型大曲中产香微生物的筛选及鉴定

本研究从传统浓香型大曲微生物资源中筛选产香功能性微生物,研究其与大曲香味物质之间的联系,并对产香功能菌株进行分子生物学鉴定。采用传统微生物分离法从不同发酵阶段的浓香型大曲中分离纯化获得细菌22株,酵母6株。以小麦固体培养基为底物对各细菌、酵母菌株进行单菌产香实验,经闻香评价,菌株X19和J3发酵后能产生浓郁的香味。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对这两株菌的发酵产物进行挥发性成分检测,发现菌株X19和J3的发酵产物中香味物质种类丰富,其中吡嗪类物质、苯乙醇、愈创木酚等香味物质为浓香型大曲的重要香味成分。因此,可初步认定菌株X19和J3为浓香型大曲的产香功能菌。经形态学观察和分子生物学鉴定,菌株X19为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),菌株J3为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。     

强化白酒大曲的制备

浓香型白酒生产所使用的曲，被称作酿造白酒的糖化发酵剂。通过微生物的分离纯化鉴定，将筛选的菌株按照一定比例复配制作强化大曲，并通过GC-IMS技术检测传统大曲和强化大曲中挥发性成分。结果可知：四株酵母菌最佳添加量为：酵母菌QJ-1添加量3%、酵母菌QJ-4添加量5%、酵母菌QJ-3添加量3%、酵母菌QJ-2添加量4%。     

汾酒大曲可培养真菌多样性的初步分析

从汾酒大曲中分离出81株真菌,并对这81株菌进行了基于rDNA序列的分子生物学鉴定.结果表明,在汾酒大曲中分布有6个属的霉菌和4个属的酵母菌,其中扣囊腹膜孢酵母是优势酵母菌种,伞枝犁头霉和匍枝根霉是优势霉菌菌种.     

天水四门大曲太空搭载前后微生物学研究

对天水四门大曲太空搭载前后微生物的种类与数量的变化进行了研究。搭载后大曲中放线菌的数量大幅度下降；醋酸菌和乳酸菌数量大量增加；酵母菌数量稍有减少；曲霉属数量增加较多，这些变化对食醋品质的形成十分有利。     

浓香型大曲中可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析

采用传统微生物分离手段从浓香型大曲中分离纯化得到69株真菌。通过形态学观察、分子生物学鉴定以及系统发育学分析其分类地位。结果表明:采用ITS区序列进行真菌的分子鉴定可将大多数的真菌鉴定到属,部分真菌甚至能够鉴定到种;浓香型大曲内分离获得的真菌类群主要包括曲霉属(Aspergillus)、红曲霉属(Monascus)、根毛霉属(Rhizomucor)、横梗霉属(Lichtheimia)、青霉属(Penicillium)、拟青霉属(Paecilomyces)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomala)、锁掷酵母(Sporidiobolus pararoseus)等目前已报道的大曲真菌类群,同时也发现了Merimbla ingelheimensis、踝节菌属(Talaromyces),尾孢菌属(Cercospora)、枝孢菌属(Cladosporium)、Acremonium impicatum、脉孢菌属(Neurospora)等霉菌类群在大曲中分布。其中曲霉属是优势种群,其菌株数目和种类最多,分别占43.48%和20.69%。本研究极大地丰富了对浓香型大曲中真菌种群的认识。     

基于26S rRNA D1/D2区序列对不同时期大曲中酵母菌的分离与鉴定

利用大曲作为糖化发酵剂是中国传统白酒主要的工艺特点之一。大曲中的微生物组成十分丰富包括各种种类的霉菌、酵母以及细菌,这些复杂的微生物体系为白酒的发酵提供了必要的微生物、酶以及风味物质。酵母菌作为所有酒类发酵生产中必不可少的微生物,在大曲的生产过程中也起到了很重要的作用。为了探究大曲中功能微生物,本文对不同时期大曲中分离的酵母菌采用26S rRNA D1/D2区序列进行分析比对,共分离鉴定了260株酵母菌,分属于22个种。主要为Wickerhamomyces anomalus,Candida orthopsilosis,Meyerozyma guilliermondii,Pichia caribbica,Saccharomycopsis fibμLigera,Cryptococcus neoformans var.grubii,Clavispora lusitaniae,Saccharomyces cerevisiae等。对序列比对的结果进行了单链构像多样性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析,确定了它们的种间差异,并构建了M-L系统树。根据这些分离鉴定的结果初步探究出大曲生产过程中不同时期酵母菌的组成和变化规律。这些结果为进一步研究中国传统白酒的酿造微生物奠定了一定的基础。     

鸭溪窖酒制曲工艺的考察及微生物的跟踪测定

在对鸭溪窖酒厂制大曲工艺考察的基础上，研究制曲水分、温湿度与大曲微生物群系消长的关系，分离、鉴定、纯化了１１８株菌株，其中细菌５３株、酵母菌２７株、霉菌３１株、放线菌７株。     

大曲中酵母菌的分离及其鉴定

本试验对大曲中酵母菌进行分离纯化,共得到8株酵母菌。从形态学和生化鉴定两方面对其进行属的鉴定。将其归入4个属,分别是汉逊酵母属、假丝酵母属、酒香酵母属和德克酵母属。     

茅台大曲中酵母的分离、鉴定及其功能初探

采用可培养方法对酱香型白酒大曲中的酵母菌进行计数和筛选,通过形态学特征、生理生化实验及酵母26S rDNA分子生物学方法鉴定酵母,并分析酵母的发酵能力和风味成分。结果表明,酱香型大曲中酵母数量为103 CFU/g;共分离鉴定6种酵母,各酵母产香能力不同,编号FBKL2.0071扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)固态发酵物具有浓郁的果香味,其中以乙酸乙酯、乙酸异戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯含量较高。编号FBKL2.0082多株伯顿丝孢毕赤酵母(Hyphopichia burtonii)固态发酵物呈浓郁的花香味,其中以乙酸乙酯、乙酸异戊酯和苯乙醇含量较高。这两株酵母固态发酵时都能产生大量的酯类和醇类等挥发性香味物质,还有少量醛、酮、酚和烷类等物质。分离得到的酵母产酒能力不同,总体产酒能力不高。     

浓香型大曲中优势蛋白酶产生细菌的分离及产酶条件研究

对浓香型大曲中蛋白酶产生细菌进行分离,并对其最适产酶条件进行研究。采用酪素培养基,从大曲中分离出5株产蛋白酶菌株,筛选出酶活力最高的菌株,其酶活为53.40 U/mL。以小麦为固体培养基,从pH值、培养基水分含量、碳源添加量、氮源添加量、接种量、培养温度和培养时间等方面研究此菌株的最适产酶条件。结果表明,在水分含量65%、初始pH6.0、蔗糖添加量6%、硫酸铵添加量1%、接种量12%、温度40℃,培养时间5 d的条件下,其酶活可达262.18 U/mL,为菌种复筛时的4.91倍。     

泸州老窖国窖曲曲坯层次间微生物差异研究

系统地研究了泸州老窖国窖曲不同层次间微生物数量、种类和优势种群差异及规律。结果表明:国窖曲层次间微生物数量、种类和优势种群差异较大,其中曲侧表层和曲包表层微生物数量多,以霉菌为主,微生物种类少,优势菌是根霉;曲包心、曲心、曲底表层微生物数量少,以细菌为主,优势菌是芽孢细菌,微生物(主要是细菌)种类较多;青霉和犁头霉主要分布在曲底层;黄曲霉、红曲霉、酵母菌均匀分布在曲坯各层。     

仰韶陶融型白酒大曲可培养微生物多样性研究

研究陶融型白酒大曲可培养微生物的多样性。采用组织培养方法分离陶融型白酒大曲的微生物,提取分离菌株DNA,用酵母通用引物NL1/NL4、细菌通用引物799F/1492R和真菌通用引物ITS1/ITS4对酵母26S rRNA、细菌16S rRNA、霉菌28S rRNA序列扩增,提交测序分析,构建系统发育树。仰韶陶融型白酒大曲酒曲中共分离到酵母213株、细菌386株、霉菌73株,酵母归分为72株形态种,细菌归分为77株形态种,霉菌归分为7株形态种,根据测序结果不同,陶融型白酒大曲微生物被分为21个分类单元。仰韶陶融型白酒大曲可培养微生物具有多样性特征,为其发酵及开发利用提供理论参考。     

传统发酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物学鉴定

通过提取羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中分离到的36 株酵母菌的基因组DNA,经聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增其26S rDNA并测定序列,将序列输入GenBank中通过基本局部序列检索工具（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST）检索确定种属（同源性≥99%）。结果表明：传统发酵牦牛酸乳中酵母菌主要为马克斯克鲁维酵母17 株（47.2%）、酿酒酵母6 株（16.7%）、平常假丝酵母5 株（13.9%）、喜仙人掌毕赤酵母4 株（11.1%）、发酵毕赤酵母3 株（8.3%）,1 株鉴定失败。并构建系统发育进化树结合分子鉴定结果分析酵母菌的遗传多样性。     

老白干酒曲中酵母菌多样性分析

采用微生物分离培养与分子鉴定相结合的方法,在对酒曲中的酵母菌进行分离、纯化和形态学鉴定基础上,进行菌株核糖体26S rDNA聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术结合的分子鉴定。并采用非培养方法,直接提取酒曲中的总DNA进行聚合酶链式反应扩增、电泳和切胶与回收,通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）法鉴定酵母菌。结果表明,采用培养方式分离到57?株6?种不同形态的酵母菌,经鉴定为5?种分子类型,分别为奥默毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）。经PCR-DGGE法鉴定得到10 株酵母菌,分别为W. anomalus、Wickerhamomyces sp.、T. asahii、热带假丝酵母（Candida tropicalis）和Candida sp.各1 株,Hyphopichia burtonii 2?株,另有uncultured Saccharomycopsis 3?株。培养与非培养两种方式共鉴定得到10 株酵母菌,分别属于8?个属,包括P. kudriavzevii、C. lusitaniae、W. anomalus、R. mucilaginosa、T. asahii、uncultured Saccharomycopsis、H. burtonii、Wickerhamomyces sp.、C. tropicalis、Candida sp.,该研究结果可为进一步研究酒曲的发酵能力提供参考。     

浓香型大曲中功能性酵母菌的筛选、鉴定及发酵特性研究

以浓香型大曲为研究对象,采用稀释涂布平板法从中分离酵母菌,对其形态特征进行观察;采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）显色法初筛,通过发酵力、产酒能力、耐高温、耐酒精能力实验进行复筛,筛选一株优良的功能性酵母菌,利用Biolog微生物自动分析系统对其进行鉴定,并利用顶空固相微萃取气质联用（HS-SPME-GC-MS）法对其液态发酵产物进行分析。结果表明,从浓香型大曲中共分离出9株酵母菌,其中菌株NDY-06性能最突出,可耐受42 ℃的高温,16%vol的酒精度,且具有一定的发酵产酒能力;该菌株被鉴定为产香酵母Zygosaccharomyces cidri,从其液态发酵产物中共检测到35种挥发性风味物质,包括醇类物质7种,酯类物质13种,酸类物质7种,吡嗪类物质3种,对白酒香气成分有一定的贡献。     

传统酱香大曲与机械化酱香大曲中酵母菌的初步研究

采用可培养方法从传统酱香大曲和机械化酱香大曲中分离筛选酵母,并对这些酵母的数量、种类及功能差异进行分析比较。结果表明,机械化酱香大曲中酵母数量为传统酱香大曲的1.44倍;传统酱香大曲中酵母种类为机械化酱香大曲的2倍;相同条件下两者中产酒性能最高的酵母产酒精度在20 ℃时均为10.2%vol,机械化酱香大曲中筛选得到的酵母菌株平均产酒性能为传统酱香大曲的1.04倍;从产香上看,两种大曲中的产香酵母均能产生醇、酸、酯、酮类挥发性物质。     

羊羔美酒大曲中酵母菌多样性及分子鉴定

目的：分离和鉴定羊羔美酒大曲中的酵母菌,探寻酵母菌群多样性组成,为深入研究羊羔美酒的风味特征奠定基础。方法：对羊羔美酒大曲实施多点采样、混合研磨、无菌水梯度稀释、平板画线分离、挑取酵母菌单菌落。酵母菌的形态鉴定采取菌落特征和显微细胞特征结合的方法,分子鉴定采用5.8S rDNA-ITS区域限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分析及序列分析法。结果：从羊羔美酒大曲中共分离出474 株酵母菌,传统形态学鉴定为14 种形态类型,经5.8S rDNA-ITS区域RFLP分析法区分为6 种分子类型。经基因序列分析,将其鉴定为分属于6 个属的6 种酵母菌,分别为：异常毕赤酵母（Pichia anomala）、酿酒酵母（Saccharomyce cerevisia）、阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）、黏质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）。结论：羊羔美酒大曲中酵母菌多样性丰富,除酿酒酵母外,还含有多种酵母菌辅助代谢产生各种风味物质,其中酿酒酵母为主要优势菌群。     

乳糖酶生产酵母菌菌株的研究

从土壤和鲜牛奶中采用X—gal定性试验和ONPG定量试验对酶活性进行测定以筛选高产乳糖酶（β-半乳糖苷酶）的菌株。结果有21株在含有X—gal的琼脂培养基上产生蓝色菌落,5株ONPG酶活较高,其中酵母菌Y6号菌株酶活最高,酵母菌Y6号菌株在发酵培养20～24h生长量和产酶量均达到最大。