纳豆激酶NKⅡ分离纯化及其酶促动力学研究

该实验主要采用疏水柱层析分离纯化纳豆激酶NKII,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果为单一蛋白条带,分子量为28 ku,酶活回收率56.51%,纯化倍数17.90,比活力达48 407.77 IU/mg。采用纤维蛋白平板法及显色底物法测定酶活力,结果表明,两种方法相关性高。以S-2251为底物的动力学研究表明,米氏常数Km值为0.379 6 mmol/L,最大反应速度Vm值为0.059 8 mmol/(L·min),Ca2+、Mg2+对酶活稳定性效果明显。     

α-淀粉酶酶解小麦面粉动力学模型研究

在研究底物质量浓度、酶用量、酶解pH值及酶解温度对α-淀粉酶酶解小麦面粉反应速率影响的基础上,采用Lineweaver-Burk作图法和Wilkinson统计法求解酶解过程的动力学常数Km和Vm,并建立酶解动力学方程。结果表明：在pH值为6.0,温度为60℃条件下,动力学常数Km为2.940mg/mL,Vm为0.348mg/(mL ·min),米氏方程为v＝----,且验证实验表明,方程的预测值与实测值基本吻合。在30～60℃的条件下,酶解动力学方程为v＝--------[E]总[S]。     

黑曲霉T3-5-1高活力单宁酶的制备及其性质研究

用黑曲霉T3-5-1生产单宁酶,将粗酶液分别采用硫酸铵沉淀法和透析法初步纯化,结果表明,使用截留分子量12 kDa的透析袋对粗酶液透析后的比活力(3108.58 U/mg),高于硫酸铵沉淀法处理后的比活力(2939.38 U/mg)。然后对透析样品用Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析法进一步纯化,得到纯度较高的单宁酶,通过与单宁酶A及单宁酶B进行GPC色谱图比较发现,其分子量基本一致,但黑曲霉T3-5-1单宁酶的比活力(5304.78 U/mg),远高于单宁酶A(1788.15 U/mg)和单宁酶B(935.07 U/mg)的比活力。该单宁酶性质研究表明:其最适pH值为5.0,最适反应温度为40℃,且其酸碱稳定性和热稳定性良好。当底物为没食子酸丙酯时,最大酶促反应速率Vmax为81.96μmol/(L·min),米氏常数Km为0.85 mmol/L。最后考察了该单宁酶的催化合成能力,结果表明,在AOT异辛烷反胶束体系中,该单宁酶可催化没食子酸和丙醇反应合成没食子酸丙酯。     

603霉菌果胶酶的动力学研究

本试验以本系分离选育的603霉菌生产的果胶酶为主,同时选用丹麦摩尔公司和无锡酶制剂厂的商品酶作对照,进行酶动力学研究。其结果如下。 603果胶酶:最适pH4.5,最适温度50℃,最适作用时间30mjn,米氏常数:Km=0.078%,Vm=150.38um1~(-1)min~(-1)。丹麦摩尔公司果胶酶:最适pH4.5,最适温度40℃,最适作用时间30min,米常氏数:Km=0.087％,Vm=106.95um1~(-1)min~(-1)。无锡酶制剂厂商品:最适pH5.0,最适温度45℃,最适作用时间35min,米氏常数:Km=0.094％,Vm=98。04um1~(-1)min~(-1)。     

荞麦淀粉耐高温α-淀粉酶液化工艺条件研究

利用耐高温α-淀粉酶能将底物同步糊化和液化的特性,通过单因素和正交试验对耐高温α-淀粉酶水解荞麦淀粉的动力学参数和最适反应条件进行了测定.结果表明:耐高温α-淀粉酶的最适温度为80～85℃,最适pH为5.0～6.5;该酶水解荞麦淀粉的Km为4.9674mg/mL,Vm为0.3448mg/(mL·min);该酶水解荞麦淀粉的优化工艺条件为荞麦淀粉浆浓度25%,温度为83℃,pH6.5,酶用量40U/g,液化时间15min.荞麦淀粉液化液糖化后的DE值为89.87%.     

菊粉酶特性的初步研究

以菊粉为底物研究了pH值、温度、底物浓度、金属离子对菊粉酶活性的影响及酶活随反应时间的变化情况，并测定该菊粉酶的米氏常数和酶活。实验结果表明，该菊粉酶反应的最适pH值为4.7，最适温度为60℃，Ca~(2+)和Zn~(2+)对菊粉酶有激活作用。该菊粉酶的米氏常数Km为0.35mol／L，V_(max)为0.52mg／min。     

露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质

露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 纯化,得到纯化152.54 倍胆红素氧化酶,得率19.14%;用PAGE 检测为单一条带,活性电泳证实该单一蛋白质组分为胆红素氧化酶, SDS-PAGE 证明该酶的相对分子质量为64 000.该酶最适反应温度为55 ℃,以胆红素为底物时最适pH值为7.5,而以ABTS为底物时最适pH值为4,该酶在pH 3～8之间都能够检测到酶活.以胆红素为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为552.06 μmol/L和38.91 μmol/(L·min);而以ABTSA为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为631.84 μmol/L和12.79 μmol/(L·min).     

角蛋白降解菌Keratinibaculum paraultunense对废弃羽毛的发酵特性研究

采用角蛋白降解菌Keratinibaculum paraultunense厌氧发酵废弃羽毛,以全培养基、无机盐培养基和纯水培养基分别进行发酵,测定了发酵过程中角蛋白酶的酶活、羽毛的降解率、可溶性蛋白和游离氨基酸的含量。研究发现,羽轴比羽枝更难被降解,但羽轴粉碎后,能达到同样的降解效果。采用无机盐培养基发酵时,主要降解产物是可溶性蛋白,含量可达0.93 mg/mL;而采用全培养基发酵时,主要发酵产物是角蛋白酶和游离氨基酸,当羽毛底物量提高到100 g/L,角蛋白酶的酶活高达11 179 U/mL。角蛋白降解菌K. paraultunense能快速高效地降解高浓度的废弃羽毛,可生产大量的可溶性蛋白和高活力的角蛋白酶。     

沙田柚皮过氧化物酶的纯化及酶学性质的研究

为了获得一种富含过氧化物酶(POD)的植物,本研究利用循环催化流动分析法(RCFA)初步筛选了15种植物样品,对样品中POD活性最高的沙田柚皮粗酶液进行了硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶层析纯化,并对已纯化的POD进行了酶学性质研究.得到的结果表明:每克沙田柚皮中POD可达15.08U,纯化后的比活力可达313.29U/mg,纯化倍率为26.22倍,POD最终产率为43.20％;优化得到的POD最适温度和pH分别为55℃和5.5,在最适条件下测得该酶以H2O2为底物的米氏常数Km为0.099mmol/L,以愈创木酚(GA)为底物的米氏常数km为0.864mmol/L.     

坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶的纯化以及酶学性质

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7发酵液进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,酶活回收率为5.13%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果为单一条带,分子质量为24.5 ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数Km=4.733 mg/mL,最大酶反应速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。     

低温果胶酶的纯化及酶学性质的研究

进行了低温果胶酶产生菌的筛选,并对低温果胶酶的酶学性质、纯化及动力学常数进行了研究。结果表明:该酶最适酶反应温度25℃,最适酶反应pH为5.8;酶液的pH稳定范围在5～6.4;在25℃保温3h,酶活降至50.5%,在35℃保温2h,酶活降至55.1%,在45℃保温1.5h,酶活降至48.7%,在55℃保温1h,酶活降至43.1%;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用,而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用;当以果胶为底物时,该酶的动力学常数Km为27.86mg/mL,Vmax为152.13μmol/(min·mL);采用不同的处理方法均可使低温果胶酶得到纯化,但40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

小麦多酚氧化酶酶学特性的研究

选取3个小麦品种作为试验材料,以邻苯二酚为底物,采用分光光度法在410 nm处测定小麦多酚氧化酶的活性,研究温度、pH值、底物浓度对其活性的影响以及酶促动力学常数Km,结果表明:小麦多酚氧化酶的最适温度范围为60～75℃,最适pH值为4.0～4.6,描述的单底物酶促反应动力学,相应的动力学参数km=0.19 mol/L,vmax=4.04×102(mol·L-1)·min-1.     

麦芽中脂肪酶活性检测及酶学性质的研究

以乙酸对硝基苯酚酯(p-NPA)为底物,采用对硝基苯酚法测定了麦芽中脂肪酶的活性,并对其酶学性质进行了研究.实验结果表明,麦芽中脂肪酶的最适反应pH为8.5,与5mmol/L的p-NPA的最适反应体积比为1∶7,金属离子Mg2+对麦芽脂肪酶活性有显著的抑制作用,Fe3+、K+则有一定激活作用;该酶热稳定性较强,40℃水浴保温120min,其酶活性几乎保持不变,70℃保温120min后接近失活.麦芽脂肪酶对p-NPA的酶动力学常数Km为0.13mmol/L,Vm值为0.016mg/min.     

蒜氨酸酶的分离纯化及其动力学特性

采用 (NH4 ) 2 SO4 盐析、SephadexG 2 0 0凝胶过滤和ConA Sepharose亲和层析方法对蒜氨酸酶进行了部分纯化 ,并研究了其酶动力学特性 ,结果表明其最适反应温度为 3 0℃ ,最适pH值为6 2 4,以蒜氨酸为底物 ,最大反应速度Vmax =1 2 0u/mg(蛋白质 ) ,米氏常数 Km =6 0 2× 1 0 - 3mol/L。文中同时研究了抑制与激活剂对蒜氨酸酶活性的影响     

Leifsonia菌β-葡萄糖苷酶（Lf18920）的酶学性质研究及对藏红花素转化作用的初步研究

克隆表达了一种赖氏菌（leifsonia spp. ZF2019）的一个GH3家族糖苷酶基因（Lf18920），以pET-28a-HMT为载体构建了表达质粒，在大肠杆菌BL21中诱导表达，用Ni-NTA柱纯化表达蛋白。研究了该酶的底物特异性及动力学参数，分析了温度、pH、金属离子等因素对该酶活性的影响，并采用高效液相色谱和液质联用色谱探究了该酶对藏红花素的转化作用。结果表明：该酶与4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl beta-D-glucopyranoside,pNPG）的亲和力最强，对底物pNPG的特征常数Vmax和Km分别为0.155U/mg和1.97 mmol/L。该β-糖苷酶的最适温度为40℃，最适pH为5.0；低浓度的Zn2+使酶活提高了37%左右，SDS和吡啶可以使酶完全失活，可耐受1%的尿素（仍能保持77%的相对酶活）。该酶能部分水解藏红花素，但不能将其彻底水解成藏红花酸。研究结果表明，该酶可用于以藏红花素为底物的不同水解度藏红花苷的制备。     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

微小毛霉凝乳酶的酶学性质研究

目的：研究微小毛霉(HL-1)凝乳酶的酶学性质。方法：研究了酶的最适温度,酶的pH值稳定性和热稳定性,探讨了金属离子、化学物质和钙离子对酶活力的影响,加酶量对酶反应的影响,测定了酶的蛋白水解活力、相对分子量和酶的Km与Vm值。结果：酶的最适温度为60℃; 最适pH值为5.5;酶在65℃保温5min活力损失95%;钙离子是酶的激活剂,其含量与酶活力正相关,而钾离子则对酶有抑制作用;氯化钠对酶活力的影响不大,但是SDS可导致酶严重失活;加酶量与反应时间成反比;酶的蛋白水解活力为485.3U/g;相对分子质量是42000,Km为0.02380mol/L,Vm为1.1227mg/min。结论：得出了微小毛霉(HL-1)凝乳酶的酶学性质。     

小麦多酚氧化酶酶学特性的研究

选取3个小麦品种作为试验材料,以邻苯二酚为底物,采用分光光度法在410nm处测定小麦多酚氧化酶（PPO）的活性,研究温度、pH值、底物浓度对其活性的影响以及酶促动力学常数Km,结果表明：小麦多酚氧化酶的最适温度范围为60～75℃．最适pH值为4．0～4．6,描述的单底物酶促反应动力学,相应的动力学参数Km=0．19mol／L．vmax=4．04×102（mol·L^-1）·min-1。     

醋酸杆菌醇脱氢酶粗酶液的特性研究

乙醇脱氢酶(ADH)是醋酸杆菌发酵生产醋酸的关键酶.以硫酸铵为沉淀剂,采用盐析法对醋酸杆菌中乙醇脱氢酶进行初步的分离纯化,并研究其酶学特性.结果表明:ADH比活力从粗酶液的0.201 U/mg提高到0.460 U/mg,纯化倍数为2.289;其最适作用pH值为7.5～8.0,pH值为7.8时酶活力达到最大,pH值为7.0时酶较为稳定;最适作用温度为35℃,温度为30℃～40℃时酶活力较为稳定,温度超过45℃后酶活力急剧下降.通过对乙醇底物浓度对ADH活力影响的研究,ADH对乙醇的米氏常数Km为2.59×10-2mol/L.