食源二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的研究进展

糖尿病是世界上最严重的代谢类疾病之一,二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)抑制剂是一种有效治疗II型糖尿病的药物。食源肽是DPP-IV抑制剂的潜在来源,可能有辅助控制血糖水平的作用。本文对食源DPP-IV抑制肽的获得方式、常规研究路线、结构特征和抑制机制进行了综述,并探讨了生物信息学方法(即肽剪切、分子对接、定量构效关系)在DPP-IV抑制肽研究中的应用及其局限性。本文也对食源DPP-IV抑制肽用作功能性食品配料以辅助调节血糖所需要的进一步研究进行了展望。     

利用牡蛎制备DPP-IV抑制肽及其活性分析

以牡蛎肉为原料制备二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV,EC 3.4.14.5）抑制肽。通过对比5 种蛋白酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶）制备的酶解液对DPP-IV的抑制活性,发现胰酶制备的酶解液对DPP-IV抑制效果最好。通过优化胰酶酶解条件,确定最优酶解条件为加酶量0.8%、pH 8.0、温度37 ℃,酶解时间90 min。酶解液经超滤、Sephadex G-15和高效液相色谱分离纯化,获得肽片段。通过质谱鉴定筛选得到2 种肽段的序列为Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys（EITALAPSTMK）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER）。利用BIOPEP在线模拟分析了这2 个肽的胃肠液消化特性。采用固相合成法合成肽段APSTM和ILAPPER,并应用于DPP-IV抑制活性研究。结果显示,2 个肽段的IC50值分别为354.81 μmol/L和16.98 μmol/L。分子对接结果表明,抑制肽与DPP-IV的活性部位主要以氢键、范德华力和π键相互作用为主。本研究通过酶解牡蛎肉制备高抑制活性的DPP-IV抑制肽,为以牡蛎为原料的功能性食品开发利用提供了理论基础。     

中国毛虾二肽基肽酶-IV抑制肽的分离纯化与结构鉴定

食源性二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)抑制肽有助于调节机体血糖。为实现中国毛虾的高值化利用，从中国毛虾酶解产物中制备DPP-IV抑制肽，使用动物蛋白酶水解中国毛虾，以DPP-IV抑制率为评价指标分离多肽，并通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明，酶解液经超滤、Sephadex G15和反相高效液相色谱分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后，得到了5条DPP-IV抑制肽，氨基酸序列分别为YGGQFPTRPD、PALPSIPH、IFTAPQVP、PAFPHPLP和LGDAPGEVP;其中PALPSIPH和PAFPHPLP对DPP-IV的抑制活性较高，二者的IC₅₀值分别为(2.68±0.06)和(1.61±0.06) mmol/mL。分子对接结果表明PALPSIPH和PAFPHPLP主要通过氢键与DPP-IV活性中心及其以外的位点相结合，以此达到抑制作用。该研究基于中国毛虾制备食源性DPP-IV抑制肽，为水产蛋白来源降血糖功能性食品开发利用和新型DPP-IV抑制肽的研究提供参考。     

海参二肽基肽酶Ⅳ抑制肽的酶解制备及结构鉴定

通过抑制二肽基肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV, DPP-IV)的活性,从而减少GLP-1的降解,提高血液中胰岛素的水平,是控制血糖水平的一种重要手段。本文以海参(Holothariatubulosa)为原料,通过探究蛋白酶种类、加酶量和酶解时间对酶解产物DPP-IV抑制活性、蛋白回收率和水解度的影响,确定了海参DPP-IV抑制肽的制备条件,并进一步测定了其分子量分布和总氨基酸组成,最后通过UPLC-MS/MS鉴定了其潜在的活性肽序列。结果发现,木瓜蛋白酶与复合蛋白酶1:1的复配酶解具有最佳的酶解效果,其产物的得率和DPP-IV抑制活性均最高,且在加酶量为干海参质量的1%,酶解时间为4 h时,海参酶解产物在终浓度为2 mg/mL时的DPP-IV抑制率为66.97%,蛋白回收率为76.25%,水解度为6.10%。酶解产物的分子量大都小于5000 u,且富含脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)等与抑制DPP-IV活性有关的氨基酸。将获得的酶解物中的肽段进行液质联用检测,并通过Mascot分析筛选得到28条具DPP-IV抑制肽的肽序列,分子量在500～1936 u。本实验结果为以海参为原料进行降血糖产品的开发奠定了基础。     

马氏珍珠贝来源DPP-IV抑制活性肽的虚拟筛选及其作用机制

为了快速发现马氏珍珠贝来源二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制活性肽,本研究利用数据库中20个已报道的DPP-IV抑制肽组成训练集,构建了药效团模型并通过测试集分子和Fisher随机验证法对模型进行了评估。利用在线网站PeptideCutter,以珍珠贝肉蛋白为原料,进行虚拟酶解。使用最优药效团模型（Hypo1）对虚拟酶解获得的192个低分子肽（氨基酸数小于或等于5）进行初步筛选,接着以分子对接的方法进一步筛选,并且对潜在的DPP-IV抑制活性肽进行固相合成,体外验证其活性并分析其作用机制。结果表明,药效团结合分子对接技术筛选了4个理论上可能具有高活性的DPP-IV抑制肽,即LPIY、VQDR、PIY和APSL。其中,VQDR、PIY没有表现出抑制活性,而LPIY和APSL具有较高的DPP-IV抑制活性,其IC₅₀值分别为521.19 和258.67 μmol/L。与DPP-IV相互作用的机理表明,肽LPIY和APSL与DPP-IV活性口袋中的氨基酸残基形成了多个氢键,且N-端第二个位置的脯氨酸（P）也均与活性口袋中的残基形成了Pi-Alkyl作用,因此促进了LPIY和APSL的DPP-IV抑制作用。本研究为高效筛选珍珠贝来源的DPP-IV抑制肽提供了理论方法。     

大米谷蛋白模拟酶解释放生物活性肽的研究

目的 通过对大米谷蛋白的模拟酶解及生物信息学分析, 评价大米谷蛋白作为生物活性肽前体的潜在价值。方法 首先, 利用计算机在UniProt蛋白质数据库中查找大米谷蛋白的序列, 使用BIOPEP活性肽数据库对所选的3条序列进行模拟酶解, 并同时对酶解产生的肽片段数量、分子量及其氨基酸组成进行统计分析。然后, 将模拟酶解产生的肽片段序列与BIOPEP数据库中已有记载的生物活性肽序列进行对比, 筛选出具有生物活性的肽片段。最后, 对模拟酶解产生的生物活性肽进行致敏性和毒性预测。结果 胃蛋白酶和木瓜蛋白酶是最适合水解大米谷蛋白的两种酶。大米谷蛋白酶解可产生许多生物活性肽, 其中出现频率最高的是二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV)抑制肽和血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制肽。大米谷蛋白本身无潜在致敏性, 且其经过计算机模拟酶解得到的DPP-IV抑制肽和ACE抑制肽均无细胞毒性。结论 大米谷蛋白可作为酶解释放DPP-IV抑制肽和ACE抑制肽的良好前体, 本研究为大米谷蛋白酶解生产生物活性肽提供了理论指导。     

驼乳乳铁蛋白DPP-IV抑制肽的筛选验证及其防治糖尿病潜在作用机制探究

目的:结合生物信息学,从驼乳乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）中筛选DPP-IV（Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制肽,并利用网络药理学探讨筛选肽段对糖尿病的潜在作用机制。方法:利用BIOPEP网站模拟酶切LF序列产生多条肽段,结合多肽数据库及分子对接筛选潜在的DPP-IV抑制肽,选择其中四条进行人工合成,验证其DPP-IV抑制活性,通过分子对接分析肽段与DPP-IV分子间相互作用方式,Lineweaver-Burk方法分析肽段抑制模式。选择抑制作用较强的GPQY进行网络药理学分析,预测其对糖尿病的潜在作用机制。采用Swiss Target Prediction和GeneCards数据库挖掘GPQY及糖尿病的作用靶点,String数据库获取蛋白与蛋白互作关系,Cytoscape 3.9.0软件构建PPI网络,DAVID数据库对靶点进行GO与KEGG通路富集分析。结果:筛选验证获得2条DPP-IV抑制GPQY和EACAF,其半抑制浓度（IC₅₀）值分别为348.27±16.11和1024.89±19.67 μmol/L,抑制模式分析表明GPQY为竞争性抑制,EACAF为混合型抑制。分子对接结果显示两条肽段通过氢键、疏水作用和静电作用与DPP-IV结合。由PPI网络筛选到GPQY有STAT3、MMP9、SRC、MAPK1等25个核心作用靶点,KEGG通路富集显示GPQY防治糖尿病通路涉及IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、肾素-血管紧张素系统、细胞凋亡等。 结论:驼乳LF是DPP-IV抑制肽的良好来源,由其获得的四肽GPQY可通过多靶点、多通路参与炎症反应,影响细胞增殖分化等多方面防治糖尿病及其并发症。     

马氏珍珠贝软体酶法制备降糖肽的工艺优化及肽段分析

目的:以二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase，DPP-IV）抑制率和葡萄糖消耗量为指标优化马氏珍珠贝软体的酶解工艺，并对酶法制备的降糖肽进行分析。方法:以人肝癌细胞（HepG-2）胰岛素抵抗模型的葡萄糖消耗量、体外二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase，DPP-IV）抑制率为评价指标，比较筛选了酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶对马氏珍珠贝软体的酶解效果，通过单因素及正交试验分析酶解温度、料液比、加酶量、酶解时间等因素对酶解物降糖活性的影响，确定最佳酶解工艺，以液相串联质谱（Nano LC-MS/MS）分析酶解物中肽类物质组成。结果:酸性蛋白酶酶解的产物葡萄糖消耗量和DPP-IV抑制率优于其他种类蛋白酶，马氏珍珠贝软体制备降糖肽的最佳酶解条件为:45 ℃、3 h、料液比1:3.5（w:w）、加酶量1000 U/g，在此条件下的葡萄糖消耗量为37.53%、DPP-IV抑制率为74.21%。最佳工艺制备的马氏珍珠贝软体酶解物中93.88%的肽段分子量低于2000 Da，22.63%的肽段为疏水性肽段，74.92%的肽段N端至少有含有一个疏水性氨基酸。结论:本研究酶法制备的马氏珍珠贝软体降糖肽可通过抑制DPP-IV的活性及减少胰岛素抵抗发挥降糖作用，对功能食品的研发具有一定的指导意义。     

基于生物信息学稻米半胱氨酸蛋白酶抑制剂来源生物活性肽的虚拟筛选及分子对接研究

稻米半胖氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC)是除贮藏蛋白外一类重要的稻米蛋白,本研究的目的是筛选稻米OC来源的生物活性肽。研究以稻米OC蛋白质序列为对象进行生物信息学分析和计算机辅助酶解,建立OC蛋白虚拟模拟胃肠道消化产物的肽数据库,预测其生物活性肽序列。进一步结合分子对接虚拟筛选具有结合潜力的活性肽并探讨其与靶蛋白的结合位点及作用方式。生物信息学分析表明稻米OC蛋白与大豆球蛋白和稻米谷蛋白类似也是生物活性肽的潜在优良来源;经人体消化酶虚拟水解后能够产生的肽段活性以ACE和DPP-IV抑制为主。分子对接表明虚拟消化产生的两种新的三肽TDW和AGR均能与ACE和DPP-IV活性部位的关键氨基酸残基形成分子间相互作用,对ACE和DPP-IV具有潜在的抑制作用。     

动物源性降糖肽的研究进展

一些食源性活性肽降糖效果显著,具有开发成功能性食品的潜力,在世界范围内引起广泛关注。其中广泛存在于食物蛋白水解物中的动物源性活性肽具有较好的降血糖特性,其潜在机制包括抑制α-葡萄糖苷酶或二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)等。本文介绍了动物源性降糖肽的制备方法、作用机理及降糖效果的评价方法,重点综述了来源于畜禽肉、鱼类、血液、乳类和蛋类等动物性食物的降糖肽的现有研究成果,为预防和辅助治疗糖尿病及相关功能性食品的开发提供了理论依据。     

Identification of dipeptidyl peptidase-IV inhibitory peptides from mare whey protein hydrolysates

Inhibition of dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) activity is a promising strategy for treatment of type 2 diabetes. In the current study, DPP-IV inhibitory peptides were identi?ed from mare whey protein hydrolysates obtained by papain. The results showed that all the mare whey protein hydrolysates obtained at various hydrolysis durations possessed more potent DPP-IV inhibitory activity compared with intact whey protein. The 4-h hydrolysates showed the greatest DPP-IV inhibitory activity with half-maximal inhibitory concentration of 0.18 mg/mL. The 2 novel peptides from 4-h hydrolysate fractions separated by successive chromatographic steps were characterized by liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry. The novel peptides Asn-Leu-Glu-Ile-Ile-Leu-Arg and Thr-Gln-Met-Val-Asp-Glu-Glu-Ile-Met-Glu-Lys-Phe-Arg, which corresponded to β-lactoglobulin 1 f(71–77) and β-lactoglobulin 1 f(143–155), demonstrated DPP-IV inhibitory activity with half-maximal inhibitory concentrations of 86.34 and 69.84 μM, respectively. The DPP-IV inhibitory activity of the 2 peptides was retained or even improved after simulated gastrointestinal digestion in vitro. Our findings indicate that mare whey protein-derived peptides may possess potential as functional food ingredients in the management of type 2 diabetes.     

Investigation into the potential of commercially available lesser mealworm (A. diaperinus) protein to serve as sources of peptides with DPP-IV inhibitory activity

Food-derived peptides are known to possess inhibitory activity against the dipeptidyl-peptidase IV (DPP-IV) enzyme, a target in the management of type 2 diabetes. While proteins from commonly consumed food commodities have been investigated as precursors of DPP-IV-inhibiting peptides, studies on novel protein sources, such as those from insects, are sparse. This research aimed to determine if DPP-IV inhibitors can be generated upon in vitro digestion or enzymatic hydrolysis of lesser mealworm protein isolate and concentrate. Treatment of the proteins with digestive enzymes and proteases generated hydrolysates with varying potency, thermolysin being the most effective at releasing active peptides (IC₅₀ = 0.63 and 0.60 mg mL⁻¹ for the isolate and concentrate). Ultrafiltration of the thermolysin-treated hydrolysates did not significantly improve the potency. This study shows that DPP-IV inhibitors can be generated from lesser mealworm protein and provides insight on the potential of insects to serve as functional food ingredients.     

Dipeptidyl peptidase-IV inhibitory peptides generated by tryptic hydrolysis of a whey protein concentrate rich in β-lactoglobulin

Dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) is a serine protease involved in the degradation and inactivation of incretin hormones that act by stimulating glucose-dependent insulin secretion after meal ingestion. DPP-IV inhibitors have emerged as new and promising oral agents for the treatment of type 2 diabetes. The purpose of this study was to investigate the potential of β-lactoglobulin as natural source of DPP-IV inhibitory peptides. A whey protein concentrate rich in β-lactoglobulin was hydrolysed with trypsin and fractionated using a chromatographic separation at semipreparative scale. Two of the six collected fractions showed notable DPP-IV inhibitory activity. These fractions were analysed by HPLC coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) to identify peptides responsible for the observed activity. The most potent fragment (IPAVF) corresponded to β-lactoglobulin f(78–82) which IC₅₀ value was 44.7 μM. The results suggest that peptides derived from β-lactoglobulin would be beneficial ingredients of foods against type 2 diabetes.     

杂色蛤酶解物的降糖活性初步评价及其物质基础研究

目的:明确杂色蛤酶解肽对降糖活性相关指标的作用,研究其肽类成分组成。方法:利用酸性蛋白酶制备杂色蛤酶解物样品,通过60%乙醇沉淀得到上清部分,采用Sep-Pak C₁₈固相萃取小柱在不同浓度乙腈洗脱条件下对分离上清部分,以二肽基肽酶-IV(DDP-IV)体外抑制模型与人肝癌细胞(HepG-2)胰岛素抵抗模型筛选杂色蛤酶解物的最佳活性部分,采用Nano LC-MS/MS串联质谱对活性部分进行分析鉴定。结果:经10%乙腈洗脱部分具有最佳的抑制DPP-IV活性作用,可促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取量,杂色蛤酶解物的10%乙腈洗脱部分中共鉴定114个多肽,其中83.3%为亲水性多肽,90.4%的肽分子量低于2000 Da,且N末端疏水性氨基酸较多。结论:杂色蛤酶解物中肽类成分可通过抑制DPP-IV的活性及减少胰岛素抵抗发挥降糖作用。     

Production of dipeptidyl peptidase IV inhibitory peptides from defatted rice bran

The insulinotropic hormone glucagon-like peptide-1 is metabolised extremely rapidly by the ubiquitous enzyme dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV). Therefore, human DPP-IV is a key regulator involved in the prevention and treatment of type 2 diabetes. To simplify the method of producing an inhibitory peptide against DPP-IV, we focused on rice bran (RB) as a source and subjected proteins from defatted RB to enzymatic proteolysis using 2 commercial enzymes. The RB peptides produced with Umamizyme G exhibited 10 times the inhibitory activity as those produced with Bioprase SP. The half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) value of the RB peptides was 2.3 ± 0.1 mg/ml. Leu-Pro and Ile-Pro were identified as the inhibitory peptides among the RB peptides produced with Umamizyme G. Ile-Pro was the strongest DPP-IV inhibitor among the 15 Xaa-Pro dipeptides and Pro-Ile tested. Ile-Pro competitively inhibited DPP-IV (K_i = 0.11 mM). Mass spectrometry indicated that the contents of Leu-Pro and Ile-Pro in the RB peptides were 2.91 ± 0.52 μg/mg.