鲟鱼皮中二肽基肽酶-IV抑制肽的分离纯化与鉴定

为从鲟鱼皮中分离提取出二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）抑制活性肽，以鲟鱼皮胶原蛋白为主要材料，利用蛋白酶进行酶解，以DPP-IV抑制率为主要考察指标，在单因素试验的基础上，进一步利用响应面法优化了鲟鱼鱼皮中DPP-IV抑制肽的制备工艺条件，确定最佳酶解条件为：酶解温度50?℃、料液比1∶100（g/mL）、pH?6.12、加酶量10?170.35?U/g、酶解时间12.12?h。在此基础上，通过超滤、凝胶层析及反相高效液相色谱的方法对酶解产物进行分离纯化；采用液相色谱-串联质谱法对多肽进行鉴定，结果显示纯化后具有DPP-IV抑制活性肽氨基酸组成为：甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-赖氨酸（GPSGLDGAK），IC50值可达（61.27±1.16）μmol/L。本研究结果可为利用鲟鱼皮生产新型的生物活性成分提供参考。     

利用牡蛎制备DPP-IV抑制肽及其活性分析

以牡蛎肉为原料制备二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV,EC 3.4.14.5）抑制肽。通过对比5 种蛋白酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶）制备的酶解液对DPP-IV的抑制活性,发现胰酶制备的酶解液对DPP-IV抑制效果最好。通过优化胰酶酶解条件,确定最优酶解条件为加酶量0.8%、pH 8.0、温度37 ℃,酶解时间90 min。酶解液经超滤、Sephadex G-15和高效液相色谱分离纯化,获得肽片段。通过质谱鉴定筛选得到2 种肽段的序列为Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys（EITALAPSTMK）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER）。利用BIOPEP在线模拟分析了这2 个肽的胃肠液消化特性。采用固相合成法合成肽段APSTM和ILAPPER,并应用于DPP-IV抑制活性研究。结果显示,2 个肽段的IC50值分别为354.81 μmol/L和16.98 μmol/L。分子对接结果表明,抑制肽与DPP-IV的活性部位主要以氢键、范德华力和π键相互作用为主。本研究通过酶解牡蛎肉制备高抑制活性的DPP-IV抑制肽,为以牡蛎为原料的功能性食品开发利用提供了理论基础。     

中国毛虾二肽基肽酶-IV抑制肽的分离纯化与结构鉴定

食源性二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)抑制肽有助于调节机体血糖。为实现中国毛虾的高值化利用，从中国毛虾酶解产物中制备DPP-IV抑制肽，使用动物蛋白酶水解中国毛虾，以DPP-IV抑制率为评价指标分离多肽，并通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明，酶解液经超滤、Sephadex G15和反相高效液相色谱分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后，得到了5条DPP-IV抑制肽，氨基酸序列分别为YGGQFPTRPD、PALPSIPH、IFTAPQVP、PAFPHPLP和LGDAPGEVP;其中PALPSIPH和PAFPHPLP对DPP-IV的抑制活性较高，二者的IC₅₀值分别为(2.68±0.06)和(1.61±0.06) mmol/mL。分子对接结果表明PALPSIPH和PAFPHPLP主要通过氢键与DPP-IV活性中心及其以外的位点相结合，以此达到抑制作用。该研究基于中国毛虾制备食源性DPP-IV抑制肽，为水产蛋白来源降血糖功能性食品开发利用和新型DPP-IV抑制肽的研究提供参考。     

马氏珍珠贝来源DPP-IV抑制活性肽的虚拟筛选及其作用机制

为了快速发现马氏珍珠贝来源二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制活性肽,本研究利用数据库中20个已报道的DPP-IV抑制肽组成训练集,构建了药效团模型并通过测试集分子和Fisher随机验证法对模型进行了评估。利用在线网站PeptideCutter,以珍珠贝肉蛋白为原料,进行虚拟酶解。使用最优药效团模型（Hypo1）对虚拟酶解获得的192个低分子肽（氨基酸数小于或等于5）进行初步筛选,接着以分子对接的方法进一步筛选,并且对潜在的DPP-IV抑制活性肽进行固相合成,体外验证其活性并分析其作用机制。结果表明,药效团结合分子对接技术筛选了4个理论上可能具有高活性的DPP-IV抑制肽,即LPIY、VQDR、PIY和APSL。其中,VQDR、PIY没有表现出抑制活性,而LPIY和APSL具有较高的DPP-IV抑制活性,其IC₅₀值分别为521.19 和258.67 μmol/L。与DPP-IV相互作用的机理表明,肽LPIY和APSL与DPP-IV活性口袋中的氨基酸残基形成了多个氢键,且N-端第二个位置的脯氨酸（P）也均与活性口袋中的残基形成了Pi-Alkyl作用,因此促进了LPIY和APSL的DPP-IV抑制作用。本研究为高效筛选珍珠贝来源的DPP-IV抑制肽提供了理论方法。     

响应面法优化酶法制备驴血红蛋白源二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽

食源性二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ,DPP-Ⅳ）抑制活性肽成为近年来健康产品研究的方向之一。本研究以驴血红蛋白为原料,采用计算机模拟蛋白水解方法筛选最佳蛋白酶,研究酶解时间、温度和加酶量对蛋白水解度（degree of hydrolysis,DH）和酶解产物DPP-Ⅳ抑制率的影响,响应面优化酶解法制备DPP-Ⅳ抑制活性肽的工艺条件。结果表明,最佳蛋白酶为蛋白酶K,驴血红蛋白源制备DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳酶解条件为：底物质量浓度1 g/100 mL、酶解时间3.15 h、温度65 ℃、pH 8、加酶量400 U/g,此条件下2 mg/mL酶解产物对DPP-Ⅳ的抑制率为53.44%。     

苦瓜皂苷与乳清蛋白水解物协同对二肽基肽酶-IV的抑制活性

为评价动植物源天然产物的二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV）抑制活性,以苦瓜皂苷（momordica saponins,MS）、乳清蛋白胃蛋白酶水解物（whey protein pepsin hydrolysates,WPPHs）、乳清蛋白胰蛋白酶水解物（whey protein trypsin hydrolysates,WPTHs）为原料,采用单因素试验和响应面分析优化水解条件,再将MS与WPPHs、WPTH进行复配,结合模拟体外消化,探究DPP-IV抑制活性。结果表明,MS、WPPHs及WPTHs具有DPP-IV抑制活性,最佳水解条件为：当酶添加量4%、pH 2.7酶解2 h时,WPPHs的DPP-IV抑制率最高为15.43%;当酶添加量4%、pH 7.6酶解4 h时,WPTHs的DPP-IV抑制率最高为14.62%。苦瓜皂苷与乳清蛋白水解物具有协同对二肽基肽酶-IV抑制活性作用,当MS与WPPHs、WPTHs的复配体积比均为1:1时,显著高于两者单独累加（p<0.05）。经胃消化后,WPPHs的DPP-IV抑制率降低2.02%,MS和WPTHs的DPP-IV抑制率升高0.99%、7.01%;经肠道消化后,WPPHs的DPP-IV抑制率升高2.23%,而MS和WPTHs的DPP-IV抑制率降低4.12%、2.70%。研究结果可为天然动植物源产物协同对二肽基肽酶-IV抑制活性提供了基础性数据,为降血糖功能性产品的开发提供新的方向。     

食源性DPP-IV抑制肽降血糖作用机制研究进展

随着全球糖尿病患者人数的逐年增加,传统的药物治疗方法面临严峻挑战。研究发现,饮食干预是辅助治疗糖尿病的一种有效手段。食物中的蛋白质经酶解后可产生多种生物活性肽。其中,与糖尿病防治密切相关的二肽基肽酶-IV（Dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV）抑制肽已从鱼类等多种食物的酶解液中被发现。海洋生物种类丰富,是制备功能性食品的重要原料来源。本文综述了食源性DPP-IV抑制肽降糖的作用机制,特别是海洋生物来源的DPP-IV抑制肽的研究进展,旨在为开发基于DPP-IV抑制肽的功能性食品提供参考。     

杂色蛤酶解物的降糖活性初步评价及其物质基础研究

目的:明确杂色蛤酶解肽对降糖活性相关指标的作用,研究其肽类成分组成。方法:利用酸性蛋白酶制备杂色蛤酶解物样品,通过60%乙醇沉淀得到上清部分,采用Sep-Pak C₁₈固相萃取小柱在不同浓度乙腈洗脱条件下对分离上清部分,以二肽基肽酶-IV(DDP-IV)体外抑制模型与人肝癌细胞(HepG-2)胰岛素抵抗模型筛选杂色蛤酶解物的最佳活性部分,采用Nano LC-MS/MS串联质谱对活性部分进行分析鉴定。结果:经10%乙腈洗脱部分具有最佳的抑制DPP-IV活性作用,可促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取量,杂色蛤酶解物的10%乙腈洗脱部分中共鉴定114个多肽,其中83.3%为亲水性多肽,90.4%的肽分子量低于2000 Da,且N末端疏水性氨基酸较多。结论:杂色蛤酶解物中肽类成分可通过抑制DPP-IV的活性及减少胰岛素抵抗发挥降糖作用。     

酶解豆类蛋白制备活性肽研究进展

豆类蛋白源活性肽具有抗氧化、血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme,ACE）抑制、二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV）抑制和抗炎等活性,在防治高血压和糖尿病等慢性疾病中起积极作用,对维护人体健康具有重要意义。该文就目前国内外豆类蛋白源活性肽的酶法制备及其活性予以综述,并对其发展趋势进行展望,旨在为健康功能性食品的研究与开发提供参考。     

海参二肽基肽酶Ⅳ抑制肽的酶解制备及结构鉴定

通过抑制二肽基肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV, DPP-IV)的活性,从而减少GLP-1的降解,提高血液中胰岛素的水平,是控制血糖水平的一种重要手段。本文以海参(Holothariatubulosa)为原料,通过探究蛋白酶种类、加酶量和酶解时间对酶解产物DPP-IV抑制活性、蛋白回收率和水解度的影响,确定了海参DPP-IV抑制肽的制备条件,并进一步测定了其分子量分布和总氨基酸组成,最后通过UPLC-MS/MS鉴定了其潜在的活性肽序列。结果发现,木瓜蛋白酶与复合蛋白酶1:1的复配酶解具有最佳的酶解效果,其产物的得率和DPP-IV抑制活性均最高,且在加酶量为干海参质量的1%,酶解时间为4 h时,海参酶解产物在终浓度为2 mg/mL时的DPP-IV抑制率为66.97%,蛋白回收率为76.25%,水解度为6.10%。酶解产物的分子量大都小于5000 u,且富含脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)等与抑制DPP-IV活性有关的氨基酸。将获得的酶解物中的肽段进行液质联用检测,并通过Mascot分析筛选得到28条具DPP-IV抑制肽的肽序列,分子量在500～1936 u。本实验结果为以海参为原料进行降血糖产品的开发奠定了基础。     

酶解制备马氏珠母贝肉ACEIP的工艺研究

以ACE抑制率为评价指标,确定蛋白酶对马氏珠母贝肉（Pinctada martensii）水解条件。六种蛋白酶中水解效果较好的酶种为胃蛋白酶。正交试验确定的水解条件为:在pH2．2、温度39℃、酶浓度3%、水解6．0h、底物浓度12%。在该条件下水解,水解液ACE抑制率可以达到81．70%,IC50值为1．323mg/ml。     

蜂王浆蛋白肽的制备及其降血糖和抗氧化活性研究

目的:研究蜂王浆蛋白的最佳酶解工艺条件,并分析所制备酶解肽的氨基酸组成、分子量分布、降血糖及抗氧化活性。方法:以蜂王浆为原料,采用碱提酸沉法提取蜂王浆粗蛋白,以α-葡萄糖苷酶抑制率和ABTS自由基清除率为评价指标,筛选出酶解蜂王浆蛋白制备降血糖及抗氧化活性肽的最佳蛋白酶,并研究蜂王浆酶解肽的体外降血糖和抗氧化活性。结果:蜂王浆降血糖及抗氧化活性肽的最佳制备工艺为:以酸性蛋白酶为酶制剂,酶添加量为6000 U/g,酶解温度为43℃,酶解pH为4.0,酶解时间为4 h,料液比为1:10。在上述条件下,制备的蜂王浆蛋白肽的氨基酸总量为82.19%,相对分子质量集中在1000 Da以下。蜂王浆蛋白肽对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC₅₀)为6.94 mg/mL,清除ABTS自由基、羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基及超氧阴离子自由基的半抑制浓度(IC₅₀)分别为14.18、0.45、11.02和18.38 mg/mL。试验结果表明,蜂王浆蛋白肽具有一定的降血糖和抗氧化活性,可为蜂王浆高值化利用及活性肽产品开发提供理论依据。     

驼乳乳铁蛋白DPP-IV抑制肽的筛选验证及其防治糖尿病潜在作用机制探究

目的:结合生物信息学,从驼乳乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）中筛选DPP-IV（Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制肽,并利用网络药理学探讨筛选肽段对糖尿病的潜在作用机制。方法:利用BIOPEP网站模拟酶切LF序列产生多条肽段,结合多肽数据库及分子对接筛选潜在的DPP-IV抑制肽,选择其中四条进行人工合成,验证其DPP-IV抑制活性,通过分子对接分析肽段与DPP-IV分子间相互作用方式,Lineweaver-Burk方法分析肽段抑制模式。选择抑制作用较强的GPQY进行网络药理学分析,预测其对糖尿病的潜在作用机制。采用Swiss Target Prediction和GeneCards数据库挖掘GPQY及糖尿病的作用靶点,String数据库获取蛋白与蛋白互作关系,Cytoscape 3.9.0软件构建PPI网络,DAVID数据库对靶点进行GO与KEGG通路富集分析。结果:筛选验证获得2条DPP-IV抑制GPQY和EACAF,其半抑制浓度（IC₅₀）值分别为348.27±16.11和1024.89±19.67 μmol/L,抑制模式分析表明GPQY为竞争性抑制,EACAF为混合型抑制。分子对接结果显示两条肽段通过氢键、疏水作用和静电作用与DPP-IV结合。由PPI网络筛选到GPQY有STAT3、MMP9、SRC、MAPK1等25个核心作用靶点,KEGG通路富集显示GPQY防治糖尿病通路涉及IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、肾素-血管紧张素系统、细胞凋亡等。 结论:驼乳LF是DPP-IV抑制肽的良好来源,由其获得的四肽GPQY可通过多靶点、多通路参与炎症反应,影响细胞增殖分化等多方面防治糖尿病及其并发症。     

酶解发酵酸肉制备抗氧化肽的工艺优化

以侗族酸肉、苗族酸肉两种酸肉为原料,采用木瓜、碱性、风味及中性蛋白酶四种蛋白酶进行酶解,测定酶解液短肽得率、羟自由基及DPPH自由基清除率,结果表明碱性蛋白酶酶解液的短肽得率(侗族86.01%,苗族82.52%)、羟自由基(侗族87.48%,苗族79.88%)及DPPH自由基(侗族74.63%,苗族87.87%)清除率最高。通过比较分析苗族酸肉较侗族酸肉短肽得率更高,因此选择以蛋白酶种类、加酶量、酶解时间及料液比为自变量的单因素试验基础上,以苗族酸肉短肽得率及DPPH自由基清除率为评价指标,采用响应面优化最佳酶解条件。结果表明,酸肉抗氧化肽最佳酶解工艺为:碱性蛋白酶添加量12600 U/g、酶解时间1 h、料液比1:1.09(m:V)。在此最优条件下酶解获得的抗氧化肽得率为83.35%,是预测值的98.99%,DPPH自由基清除率力为84.01%,是预测值的97.33%,与预测值基本一致,表明以碱性蛋白酶酶解的酸肉肽具有较高的抗氧化活性及营养价值,同时为酸肉抗氧化肽的开发及利用提供理论依据。