转糖基β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶

研究利用具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶生产含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。含低聚半乳糖的低乳糖牛奶既能解决乳糖不耐症问题，同时还在牛奶中增添了低聚半乳糖双歧因子。从Enterobacter sp．B5的无细胞抽提液中，利用硫酸铵沉淀制备具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶，作用鲜牛奶生成含低聚半乳糖的低乳糖牛奶。利用薄层层析、高压液相色谱技术和软件NIHImageJ1．36分析了反应产物中的糖组分（葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚糖（包括转移二糖和三糖））。结果显示酶作用后的鲜牛奶中大约70％的乳糖转化为葡萄糖和半乳糖，至少10％的乳糖通过转糖基反应生成低聚半乳糖。在酶浓度为3U／ml，50℃酶解4h的反应条件下，获得含低聚半乳糖的低乳糖牛奶的糖组成为0．59％低聚半乳糖（含0．37％转移二糖和0．22％三糖），1．33％乳糖，2．83％单糖。本研究利用软件NIHImageJ1．36定量分析样品糖组分的TLC结果，可以避免乳糖的同分异构体．转移二糖在高压液相色谱结果中因无法分离而造成的漏检。     

半制备高效液相色谱-离子色谱法检测婴幼儿配方食品中低聚半乳糖的含量

优化并建立了半制备高效液相色谱法分离和收集、离子色谱法测定婴幼儿配方食品中低聚半乳糖的方法。本实验以乳粉、特殊医学配方奶粉和液态奶为实验对象,利用半制备高效液相色谱法分别收集婴幼儿配方食品中的二糖和三糖及聚合度(Degree of polymerization,DP)3以上的糖,再利用β-半乳糖苷酶水解收集到的聚合度3及3以上的糖组分,利用离子色谱法测定酶解后的半乳糖和葡萄糖的含量,通过计算得到样品中低聚半乳糖的含量。半制备高效液相色谱馏分固定相为Ag+色谱柱(200 mm×10 mm),流动相为100%超纯水,流速0.3 mL/min,进样量100 μL,柱温80℃;离子色谱条件固定相为Carbo Pac PA-1色谱柱(250 mm×4 mm),流动相为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液、0.5 mol/L的乙酸钠和超纯水梯度洗脱,柱温30℃,进样量25 μL。测定的异乳糖、葡萄糖、半乳糖、1,6-β-D-半乳二糖和1,3(4)-β-D-半乳二糖线性范围在1.0～30.0 μg/mL,相关系数在0.9985～0.9999,回收率在82.80%～87.67%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)≤5%。该方法结果准确,能够满足检测要求,前处理操作简单,便于大批量样品的检测。     

低聚半乳糖的分离纯化

对含有低聚半乳糖、半乳糖、乳糖和葡萄糖的糖浆,运用离子交换树脂法分离提纯低聚半乳糖,应用均匀设计法优化分离纯化条件,并采用薄层层析法对低聚半乳糖进行测定。结果:温度60℃、流速3mL/min、进料量10mL,在柱高为600mm时,低聚半乳糖在最佳分离范围中的含量可达63.8%。     

南瓜多糖的提取及纯化

南瓜是一种具有药用价值的食品,实验用热水浸提、醇析、Severge法除蛋白,水相透析得到南瓜粗多糖,通过DEAE-Sepharose和SephadexG-100柱的分离纯化得到2种水溶性多糖,经酸解,纸色谱分析得组分1的单糖组成为D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖和葡萄糖醛酸,组分2的单糖组成为D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和葡萄糖醛酸。     

黄芪多糖的相对分子量测定及单糖组成分析

采用热水提取、乙醇沉淀获得黄芪多糖。经离子交换树脂柱分离纯化,高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定多糖的相对分子质量。硫酸水解、NaOH中和后,用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生。衍生物采用高效液相色谱法测定单糖组成。结果表明:黄芪经水提取醇沉,用Sevage法脱蛋白后,获得黄芪多糖(APS);DEAE-树脂柱层析获得3个黄芪多糖组分APS-1、APS-2和APS-3,相对分子质量分别为43161、281245和198128。柱前衍生高效液相色谱分析可知:APS-1由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖组成,其物质的量比为1.0:24.8:2.5;APS-2由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成,其物质的量比为1.2:1.0:19.3:2.5:8.7;APS-3由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成,其物质的量比为1.0:2.1:4.8:1.4:3.6。     

高效离子交换色谱法测定半乳糖、葡萄糖、乳糖及低聚半乳糖含量

建立离子色谱法定量测定以乳糖为原料、使用β-半乳糖苷酶生产的低聚半乳糖产品的方法。样品前处理过程中用体积稀释法代替质量稀释法,采用高效CarboPac PA20阴离子交换色谱柱和积分安培法检测,并对淋洗液组成进行优化。优化后的方法加标回收率90.58%～99.45%,相对标准偏差为3.54%。半乳糖、葡萄糖、乳糖的方法检出限分别为0.24、0.59、0.75 μg/g。半乳糖和葡萄糖在0.2～7 μg/mL、乳糖在0.6～10 μg/mL的范围内,其质量浓度与峰面积线性关系良好,相关系数在0.999 2～0.999 9之间。用此方法测定6 种原料低聚半乳糖,目标组分总含量为95.84%～101.19%。     

超高效液相色谱法直接测定糖浆中低聚半乳糖质量分布

目的建立一种超高效液相色谱-蒸发光散射检测器联用测定糖浆中低聚半乳糖质量分布的方法。方法采用Agilent Poroshell 120 HILIC(3.0 mm×100 mm,2.7μm)色谱柱分离,以乙腈-水梯度洗脱。通过调节进入蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector,ELSD)的流动相流速以及组成来校正不同聚合度聚半乳糖的响应一致性。以葡萄糖、乳糖、麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖为校正溶液来建立校正方法,校正后以乳糖标准曲线来定量其他低聚半乳糖,最终完成了在没有低聚半乳糖标准品的情况下对低聚半乳糖糖浆质量分布的测定。结果样品中的乳糖与其他半乳二糖分离的同时不同聚合度的低聚半乳糖按聚合度增加分段出峰,互不干扰。乳糖在0.25~5 mg/mL范围内线性良好,log(峰面积)-log(浓度)的线性拟合曲线,相关系数r~2为0.996。以麦芽四糖和麦芽五糖来验证方法准确性,所得回收率分别为107%和110%。方法重现性良好,以2mg/mL乳糖为考察对象,连续6针进样保留时间RSD0.05%,峰面积RSD0.78%。结论该方法可快速、准确用于低聚半乳糖糖浆中不同聚合度半乳糖的质量分布。     

基于指纹图谱的食品级低聚半乳糖组成分析与有效组分含量推算

利用高效液相色谱—蒸发光检测法(HPLC-ELSD)建立基于指纹图谱分析的低聚半乳糖成分比较与组分含量推算方法。采用该方法对11个匿名食品级低聚半乳糖产品进行含量分析与比较。研究结果表明,现阶段食品级低聚半乳糖产品组成接近,非有效组分主要由葡萄糖、半乳糖和乳糖构成;有效组分色谱峰个数1~2个,质量浓度范围为73.65~100.00g/100g,主要由聚合度大于3的低聚半乳糖混合构成,部分产品中有效组分仅为异乳糖。通过该方法的建立与应用,可实现对低聚半乳糖产品质量差异的有效评价。     

荧光标记-酶识别-高效液相色谱法测定婴儿配方乳粉中反式低聚半乳糖

目的 建立荧光标记-酶识别-液相色谱法的婴儿配方乳粉中反式低聚半乳糖(trans- galactooligosaccharides, TGOS)的测定方法。方法 利用还原氨化反应将奶粉中的TGOS进行荧光标记, 利用β-半乳糖苷酶专一性水解TGOS的特性识别样品中的荧光标记TGOS, 采用高效液相色谱-荧光检测器进行分离检测, 通过分析β半乳糖苷酶处理与非酶解处理组样品色谱图中各相同聚合度TGOS保留时间区间的峰面积差异, 计算TGOS含量, 并用液相质谱联用法进行了验证。结果 在本研究色谱条件下, 乳糖和另外3种低聚半乳二糖实现了分离, 通过质谱验证表明, 低聚麦芽糖(DP2~DP6)与各聚合度TGOS呈现规律性出峰顺序。昆布三糖和实验中各聚合度TGOS的摩尔灵敏度无显著差异(P>0.05)。在0.032~0.321 μmol添加范围内, 荧光标记昆布三糖摩尔量和色谱峰面积呈现出良好的线性关系(r=0.9992)。以已知含量的TGOS糖浆做加标实验, 回收率为90.0%~99.1%, 满足实验要求。结论 该方法能实现高乳糖含量样品中乳糖和TGOS的色谱分离, 适用于高乳糖含量样品中TGOS的定性定量检测。     

新疆昆仑雪菊多糖的分离纯化及其结构的初步鉴定

以新疆昆仑雪菊为原料,采用超声波辅助法提取雪菊多糖（KSCP）,经脱蛋白、脱色、透析、DEAE-52层析柱和SephadexG-100凝胶层析柱纯化后,获得两个多糖组分（KSCP1和KSCP2）;将分离纯化后的多糖组分经紫外光谱分析法、冻融分析法、SephadexG-100凝胶柱层析法对其纯度进行鉴定;采用凝胶渗透色谱法和气质联用法（GC-MS）对KSCP分子质量范围和单糖组成进行分析。结果表明,KSCP1和KSCP2均为单一组分;KSCP1是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖4种单糖组成,其摩尔比为10.53∶5.02∶4.96∶1,分子质量范围为8 200～8 700 u;KSCP2主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖3种单糖组成,其摩尔比为1∶2.78∶5.07,分子质量范围为6 100～6 500 u。     

液相色谱双柱法和高效离子交换色谱法测定低聚半乳糖含量比较

目的:优化对比液相色谱双柱法和高效离子交换色谱法两种测定低聚半乳糖含量的方法,同时建立一种新的低聚半乳糖换算系数(K值)计算方法;方法:对现有上述两种测定低聚半乳糖含量的检测方法进行对比分析,筛选出分离效果更好的糖柱,并进一步优化色谱条件。结果:优化后的液相色谱双柱法对低聚半乳五糖到低聚半乳八糖的分离效果明显提升,提高了测定准确度,而高效离子交换色谱法操作更加简便;根据不同样品选用不同K值来计算低聚半乳糖含量的方式可进一步提升结果的精确性。结论:两种方法均可有效对低聚半乳糖含量进行检验分析,高效离子交换色谱法检测灵敏度较高,且已被AOAC等国际权威机构纳入标准检测方法,可作为低聚半乳糖含量测定的标准仲裁法;液相色谱双柱法测定低聚半乳糖更为简便快捷,经济适用,可用于生产企业日常产品检测。     

液相色谱双柱法和高效离子交换色谱法测定低聚半乳糖含量比较

目的:优化对比液相色谱双柱法和高效离子交换色谱法两种测定低聚半乳糖含量的方法,同时建立一种新的低聚半乳糖换算系数(K值)计算方法;方法:对现有上述两种测定低聚半乳糖含量的检测方法进行对比分析,筛选出分离效果更好的糖柱,并进一步优化色谱条件。结果:优化后的液相色谱双柱法对低聚半乳五糖到低聚半乳八糖的分离效果明显提升,提高了测定准确度,而高效离子交换色谱法操作更加简便;根据不同样品选用不同K值来计算低聚半乳糖含量的方式可进一步提升结果的精确性。结论:两种方法均可有效对低聚半乳糖含量进行检验分析,高效离子交换色谱法检测灵敏度较高,且已被AOAC等国际权威机构纳入标准检测方法,可作为低聚半乳糖含量测定的标准仲裁法;液相色谱双柱法测定低聚半乳糖更为简便快捷,经济适用,可用于生产企业日常产品检测。     

高效液相色谱法测定低聚半乳糖的含量

研究了高效液相色谱法测定乳制品及糖浆中低聚半乳糖含量的方法。以水和乙腈为流动相,用氨基柱将葡萄糖,半乳糖和乳糖与其他物质分离,用示差折光检测器检测,定量。通过计算低聚半乳糖酶解成的半乳糖含量,来对低聚半乳糖定量。葡萄糖,半乳糖,乳糖和低聚半乳糖的相对标准偏差分别为2.72%、4.16%、1.16%、4.26%。此法的线性相关系数为0.9990～0.9995,回收率达到95%～110%。此法能快速准确的测定低聚半乳糖的含量。     

高效液相色谱法分析大豆和大豆低聚糖浆中糖的组成与含量

采用高效液相色谱法(HPLC)对大豆种子及市售的大豆低聚糖浆中的可溶糖进行了分析,并利用α-半乳糖苷酶酶解大豆低聚糖浆及结合HPLC分析来推测大豆低聚糖浆的糖组成。HPLC分析条件为:Sugar-D色谱柱,75%乙腈为流动相,柱温40℃,流速为1.0ml/min,示差折光检测器。Sugar-D色谱柱的分离效果好,基线稳定,相对标准偏差1.0%～2.0%,标准回收率96.7%～100.7%。分析结果表明大豆种子和市售的大豆低聚糖浆中均含有果糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、水苏糖以及二种保留时间介于蔗糖与蜜二糖之间的未知成分,而大豆低聚糖浆中还含有葡萄糖(半乳糖)和甘露三糖;大豆种子中主要含有蔗糖和水苏糖,而大豆低聚糖浆中含有较多的蔗糖、果糖、水苏糖和葡萄糖(半乳糖),功能性低聚糖主要为水苏糖和甘露三糖。     

甘油半乳糖苷的分离纯化及鉴定

以半乳糖和甘油为原料,β-半乳糖苷酶为催化剂,制备甘油半乳糖苷。采用活性炭吸附法对其分离纯化,采用L9（34）正交试验对分离纯化的工艺条件进行优化筛选,进一步用G-15色谱柱纯化,以获得高纯度的甘油半乳糖苷。结果表明：活性炭吸附法分离纯化甘油半乳糖苷的最佳工艺条件为反应液稀释倍数20、活性炭用量2 g/mL、洗脱剂乙醇体积分数30%,甘油半乳糖苷的回收率和纯度分别为62.53%和48.84%,分别比单因素试验结果高4.52%和4.76%;经G-15柱色谱进一步纯化,甘油半乳糖苷的纯度达到97.80%;经质谱鉴定合成产物为甘油单半乳糖苷。     

柱前衍生液相色谱荧光检测法测定婴幼儿配方乳粉中的低聚半乳糖

目的建立一种柱前衍生高效液相色谱荧光检测法测定婴幼儿配方乳粉中的低聚半乳糖含量的分析方法。方法样品用2-氨基苯甲酰胺衍生后,经色谱柱分离,用高效液相色谱-荧光检测器检测,外标峰加和分段法定量。结果建立的方法可以测定婴幼儿配方乳粉中的低聚半乳糖含量。采用麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖建立标准曲线,在1～250μg/mL线性范围内相关系数(r~2)大于0.999。回收率为85.9%～103.5%,相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)小于5%,检出限为1.0 g/kg,定量限为3.0 g/kg。结论本方法方法重现性好,精密度高,解决了婴幼儿配方乳粉中高含量乳糖对低聚半乳糖测定的干扰问题,可以为食品中低聚半乳糖的定量提供良好的解决方案。     

麦胚降血糖肽的分离纯化及鉴定

建立麦胚降血糖肽的分离纯化方法及鉴定活性多肽的结构组成。采用胰蛋白酶酶解麦胚蛋白,得到降血糖多肽,并进行降血糖动物实验。超滤获得高活性组分,离子交换吸附实验选择最佳的树脂,并对麦胚降血糖肽进行离子交换吸附分离,SephadexG-25和SephadexG-15分离,再经过反相高效液相色谱（reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC）分离高活性成分。最后采用高效液相色谱-电喷雾-质谱（HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry,HPLC-ESI-MS）鉴定活性多肽的结构组成。结果显示酶解麦胚蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制性IC50为10.98?mg/mL,能够缓解糖尿病小鼠的症状。超滤获得分子质量小于5?kDa的高活性组分,IC50为1.60?mg/mL。732型阳离子交换树脂的分离效果最好,2.5%氨水的洗脱率为98.13%,通过动态离子交换吸附分离后,活性显著提高,IC50为0.30?mg/mL。通过SephadexG-25和SephadexG-15分离得到高活性组分,经RP-HPLC分离得到8?个组分（峰）,其中1号峰的活性和含量都最高,IC50为0.098?mg/mL。HPLC-ESI-MS结果显示m/z?274.45的丰度比较高,经离子碎片拼接,共有7?种多肽,其中二肽有1?种,三肽有6?种。本研究对于开发具有降血糖功效的新型功能性食品有一定的作用。     

海带中褐藻糖胶分级纯化及结构分析

为了纯化海带褐藻糖胶及研究褐藻糖胶结构,利用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离海带褐藻糖胶粗品,得到LP-1、LP-2、LP-3和LP-4 4个组分,通过Sephadex G-150凝胶柱对硫酸根含量较高组分LP-2、LP-3和LP-4进行进一步分离纯化及分子量测定,最终LP-2获得两种均一多糖LP-21和LP-22,其分子量分别为123和105 k Da,LP-3和LP-4为均一多糖,分子量分别为74和32 k Da。通过高效液相色谱法分析得率较高的组分(LP-21、LP-22和LP-3)单糖组成,用红外色谱法分析其结构。高效液相色谱结果表明,分级纯化后的组分(LP-21、LP-22和LP-3)主要由L-岩藻糖、D-半乳糖组成,还有少量D-葡萄糖、D-甘露糖、D-氨基葡萄糖、L-鼠李糖、D-木糖和D-葡萄糖醛酸。红外光谱分析表明,LP-21和LP-22的硫酸根主要结合在岩藻糖C_4位,LP-3硫酸根主要结合在岩藻糖C_2或C_3位上。     

生姜皮多糖的分离纯化及其结构组成分析

以生姜皮为原料,经热水浸提法,乙醇醇沉得到生姜皮粗多糖。再经DEAE-纤维素-52阴离子交换柱和Sephadex?G-100凝胶柱对所得粗多糖进行层析纯化,得到3种水溶性生姜皮多糖(GE-1、GE-2、GE-3)。利用高效液相色谱与蒸发光散射检测器联用测定各多糖组分的分子质量,利用柱前衍生高效液相色谱法分析各多糖组分的单糖组成,通过紫外光谱扫描、红外光谱扫描进一步分析各组分多糖结构。结果表明3种纯化多糖组分总糖含量分别为(98.06±0.15)%、(97.41±0.42)%、(97.89±0.22)%,分子质量分别为462、194 k D和376 k D。GE-1的单糖组成主要为甘露糖、葡萄糖、木糖,含有微量的半乳糖,其物质的量比为1.25∶6∶1;GE-2的单糖组成主要为甘露糖、葡萄糖和岩藻糖,其物质的量比为2.51∶9.25∶1;GE-3的单糖组成主要为甘露糖、核糖、半乳糖、阿拉伯糖,其物质的量比为17.39∶1∶1.89∶1.23。紫外光谱扫描结果显示3种多糖组分无明显的核酸和蛋白质吸收峰,红外光谱结果分析得出GE-1、GE-2和GE-3含有多糖类物质的特征吸收峰。     

低聚半乳糖含量的测定方法

研究了离子色谱法测定糖浆中低聚半乳糖含量的方法。用水、250 nmol/L NaOH溶液和1 mol/L乙酸钠溶液梯度淋洗,选用CarboPac PA10(2 mm×250 mm)色谱柱和安培检测器,测定了糖浆中各组分(乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳糖)的含量。3种糖在测定条件下线性相关系数为0.999 0~0.999 7,相对标准偏差为1.54%~3.42%,样品的加标回收率为91.7%~95.7%。