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1唾液酸简介唾液酸(Sialic Acid)广义地说是一系列含有氨基的九碳单糖衍生物,是所有神经氨酸及其衍生物的总称。但在人体当中只有一种,即N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac),它就是众所周知,大名鼎鼎的"燕窝酸"。因此,对我们人类来说,唾液酸就是特指"N-乙酰神经氨酸"。它最初由牛颌下腺粘蛋白中分离而出,也因此而得名唾液酸。唾液酸通常以低聚糖,糖脂或者糖蛋白的形式存在,主要以短链残基的形式     

高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的 N-乙酰神经氨酸

目的建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定母乳中N-乙酰神经氨酸的分析方法。方法用盐酸对样品进行酸水解释放出母乳中的结合态N-乙酰神经氨酸,高速离心后,采用C_(18)柱进行分离。以0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸-水溶液作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾质谱检测,正离子多反应监测模式(MRM)进行定性和定量分析。结果在优化的条件下,N-乙酰神经氨酸在0.01~0.5 mg/L范围线性关系良好(r=0.9997)。以10、50、100 mg/kg 3个添加水平进行加标回收试验,N-乙酰神经氨酸的平均回收率为95.0%~98.7%,相对标准偏差为11.6%~14.5%,N-乙酰神经氨酸的检出限为0.21μg/kg。结论该方法简单、快速、重复性好、灵敏度高,可广泛用于母乳中N-乙酰神经氨酸的测定。     

N-乙酰神经氨酸合成途径在枯草芽孢杆菌的构建

对食品安全认可的枯草芽孢杆菌进行菌株改造,利用生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸。首先通过基因合成获取来自枯草芽孢杆菌溶源体的P_(holin)启动子并构建了p MK4-P_(holin)-GFP质粒,转入枯草芽孢杆菌,以GFP为报告基因,对P_(holin)及其它常见的强启动子进行了转录效率的比较,然后将优化后的P_(holin)用于构建N-乙酰神经氨酸表达质粒p MK4-P_(holin)-neu BC。研究结果显示:P_(holin)启动子是一种优异的枯草芽孢杆菌组成型强启动子,在利用LB进行发酵培养的实验中,P_(holin)的转录效率为同样方式构建下的P43启动子的2.62倍。通过N-乙酰神经氨酸表达质粒,可以成功地在枯草芽孢杆菌168菌株中实现N-乙酰神经氨酸的重组生产,摇瓶培养中N-乙酰神经氨酸的产量为0.226 g/L。本文为枯草芽孢杆菌进行N-乙酰神经氨酸的工业化发酵生产奠定了研究基础。     

9种鱼卵中的游离态及结合态唾液酸含量的分析比较研究

从不同品种鱼卵中提取出游离态唾液酸和总唾液酸，采用DMB试剂对这2种唾液酸分别进行衍生化标记，再利用高效液相色谱(HPLC)系统性对比分析了9种鱼卵中N-乙酰神经氨(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的存在形式及含量的差异。结果表明，游离态和结合态的Neu5Ac在鲫鱼鱼卵中含量最高，每克鱼卵干重中分别含1.61μg和4.07μg;Neu5Gc仅存在于黄花鱼、鳜鱼和鲂鱼的鱼卵中，其中鲂鱼鱼卵中游离态Neu5Gc含量最高，每克鱼卵干重中含0.57μg；而鳜鱼鱼卵中结合态Neu5Gc含量最高，每克鱼卵干重中含0.24μg。以上结果为鱼卵的深度开发利用提供理论依据。     

离子色谱法测定母乳和牛乳中的N-乙酰神经氨酸

目的:母乳及动物乳汁中含有丰富的N-乙酰神经氨酸。本研究拟建立方法用于测定不同乳汁中N-乙酰神经氨酸。方法:本文采用高效阴离子交换色谱偶联脉冲安培检测器法(HPAEC-PAD)建立并验证测定母乳及牛乳中总N-乙酰神经氨酸的方法。结果:方法前处理简单,在较宽的分析范围(20.7～4 000 mg/L)内线性良好,相关系数大于0.999,母乳样品中的检出及定量限分别为4.3 mg/L和20.7 mg/L,准确性和精密度良好,加标回收率在86.1%～99.3%之间,平均回收率92.7%,6次重复测量RSD低于1.9%。测定不同泌乳阶段的母乳及市售牛乳中N-乙酰神经氨酸的结果显示,产后1年内母乳中总N-乙酰神经氨酸含量在187.1～1 334.7 mg/L,其随泌乳期的延长呈下降趋势。其中,游离态N-乙酰神经氨酸的比例在1.0%～2.5%。5种市售牛乳中总N-乙酰神经氨酸的含量范围为177.6～228.9 mg/L,其中游离态N-乙酰神经氨酸的比例在8.5%～11.2%。结论:该方法可用于快速准确地测定母乳及牛乳中总N-乙酰神经氨酸的含量。     

重组大肠杆菌全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸

N-乙酰神经氨酸具有多种生物学功能,在食品添加剂和药物合成等方面有着重要的应用。为了降低成本,作者利用重组大肠杆菌,并以含有N-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物进行全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸。结果表明,在温度为30℃、转化液初始pH为6.5、底物丙酮酸浓度为1.38 mol/L、Triton X-100添加质量分数为0.4%、菌体OD₆₀₀为30的条件下在5 L发酵罐等条件下进行全细胞转化,可以得到N-乙酰神经氨酸180 mmol/L,摩尔转化率为65.45%。用阴离子树脂对产物进行初步分离纯化,经高效液相色谱分析证实纯化后产品为高纯度N-乙酰神经氨酸,其纯度为98.3%,结晶回收率为42.5%。作者建立并优化了一种以含有N-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物直接进行全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的工艺流程,既节约了成本,又具有可持续发展的优势。     

高效液相色谱法测定母乳中唾液酸含量

建立荧光高效液相色谱(fluorescence detector-high performance liquid chromatography,HPLC-FLD)测定母乳中唾液酸N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolyl neuraminic acid,Neu5Gc)含量的分析方法。利用酸水解法释放出母乳中的唾液酸,以4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride,DMB)为衍生化试剂,50℃避光衍生150min,采用荧光高效液相色谱仪检测。色谱条件：LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-超纯水(7:8:85),流速0.9mL/min,进样体积10μL,柱温30℃,荧光检测器激发波长373nm,发射波长448nm。结果表明：唾液酸在50～400μmol/L范围内与唾液酸峰面积的线性关系良好,平均回收率为94.0%,精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.4%,稳定性RSD为1.0%,重复性RSD为0.8%,Neu5Ac的最低检出限为0.02μmol/L,Neu5Gc的最低检出限位0.03μmol/L。该方法简单、重复性好、灵敏度高,可广泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸含量测定。     

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆及表达

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)是合成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶。该酶的高效表达是提高全细胞细胞催化法合成Neu5Ac的有效途径。根据集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)AGE编码基因slr1975序列信息和大肠杆菌密码子偏好性,优化密码子并人工合成目的基因序列slr975-co。将该基因克隆到表达载体pET28a中,构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-slr并实现了目的基因的诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白质的相对分子质量在43 000左右,与预期大小一致,纯化产物蛋白质质量浓度约为1.7 g/L。重组AGE的最适反应温度为42℃,最适反应pH为6.0。AGE对GlcNAc、ManNAc的Km值分别为39.0、46.5 mmol/L。以分别表达AGE和N-乙酰神经氨酸裂合酶(NanA)的重组大肠杆菌作为催化剂,以N-乙酰-D-葡萄糖胺为底物,实现了N-乙酰-D-神经氨酸的全细胞催化合成。结果表明,对AGE密码子进行优化实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为全细胞催化法高效合成N-乙酰-D-神经氨酸奠定了坚实的基础。     

欧盟授权将N-乙酰神经氨酸列入新食品成分

正2017年12月15日,欧盟委员会公报发布2017/2375号文件,根据欧洲议会和理事会(EC)第258/97号条例,授权将N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid)作为新食品成分投放欧盟市场。具体内容为:一是附件I对N-乙酰神经氨酸定义、理化指标等进行了规定和说明,可用于附件II中授权使用的风味饮料、食品补充剂等食品类别,并在附件Ⅱ中规定了最大使用限量;     

N-乙酰神经氨酸增强小鼠免疫力功能研究

目的：探究N-乙酰神经氨酸增强小鼠免疫力的功能。方法：经口给予小鼠8、17、50mg/kg·BW剂量的N-乙酰神经氨酸30 d，按《保健食品功能检验与评价方法》中有助于增强免疫力检验方法，测定小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性，此外还用试剂盒测定了小鼠血清中IL-2、IL-12(P40)、TNF-α、IFN-γ含量。结果：中、高剂量组抗体生成细胞数、中剂量组半数溶血值及中、高剂量组巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率均显著高于阴性对照组，可判定小鼠体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能结果阳性。中、高剂量组小鼠血清中IL-12(P40)含量显著高于阴性对照组。N-乙酰神经氨酸对小鼠其他指标无明显影响。结论：依据《保健食品功能检验与评价方法》中的结果判定标准，N-乙酰神经氨酸有助于增强免疫力。     

红肉中N-羟乙酰神经氨酸在人体中的代谢途径及危害

唾液酸(Sialic acid,Sia)是一类含有9个碳骨架的酸性糖类,在胚胎和中枢神经系统发育、细胞识别、黏附、分化、信号传导等多方面具有重要的生理意义。N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)是一种含有9个碳原子并具备吡喃糖结构的酸性氨基糖。Neu5Gc作为唾液酸中的一种比较特殊的存在,与人类癌症以及动脉粥样硬化、2型糖尿病等疾病的发生发展有着密切联系。该文主要阐述了Neu5Gc的基本结构以及在人体的来源、代谢、吸收和蓄积的过程,并介绍了红肉特异性致病理论及Neu5Gc的危害。     

解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)源唾液酸醛缩酶基因的异源表达及其活性研究

为发掘新型唾液酸醛缩酶,使其在大肠杆菌中得到高效表达,本研究首次从菌株Pedobacter heparinus中克隆疑似编码唾液酸醛缩酶的PhNeuLy3300基因片段,并构建可自主表达异源蛋白的组成型表达载体pRSF-EM5。在此基础上将克隆的目的基因分别导入该pRSF-EM5载体和常用的诱导型载体pET-30a,构建重组质粒pET30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300,经大肠杆菌表达系统异源表达目的蛋白,并进一步对两种重组蛋白酶进行电泳分析和活性研究。结果表明:编码唾液酸醛缩酶的基因片段全长为945 bp,共编码314个氨基酸残基;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两种重组蛋白表观分子量约为36.4 kDa,纯化后的pET30a-PhNeuLy3300重组蛋白浓度为3.29 mg/mL,证明经异源表达获得了两种重组目的蛋白酶;活性研究显示两种重组唾液酸醛缩酶均能在1 h内催化N-乙酰神经氨酸生成N-乙酰甘露糖胺,证明两种重组蛋白酶均具有较高的活性。     

生物转化合成N-乙酰神经氨酸的关键因素

在前期工作中已构建了一株能以外源N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和胞内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为底物,生物转化合成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的重组大肠杆菌,但其合成Neu5Ac的效率有待进一步提高。通过调整生物转化阶段培养基中氮源和碳源的组成,探寻Neu5Ac合成过程中的关键限制性因素。结果表明,增加唾液酸合成酶NeuB活性的措施没有提高Neu5Ac的产率,而底物之一胞内PEP的供给不足是限制Neu5Ac合成的关键性因素。通过限制转化培养基中的氮源,抑制重组大肠杆菌的生长,避免了PEP被用于细胞自身生长而更多地流向Neu5Ac合成方向;通过改用不依赖PTS跨膜转运系统的甘油作为碳源,在甘油/无氮转化培养基中Neu5Ac合成量最终达到(4.42±0.08) g/L,比初始合成条件高出10.3倍。     

奶粉中N-乙酰神经氨酸的检测

建立一种高效液相色谱荧光测定奶粉中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)含量的分析方法。该方法利用酸水解释放出奶粉中的Neu5Ac,用邻苯二胺盐(OPD)作为衍生化试剂,80℃避光衍生100 min,采用高效液相色谱荧光检测。色谱条件为:用Thermo Hypersil GOLD柱(250mm×4.6mm, 5μm)分离;流动相选择超纯水-乙腈作为梯度洗脱,柱温为30℃,流速为1.0mL/min;进样体积为10μL;荧光检测器激发波长为337 nm,发射波长为448 nm。结果表明:N-乙酰神经氨酸在0.5～200μg/g范围内线性关系良好(R~2=0.9994),回收率为98%～119%,检出限为0.5μg/g。该方法具有灵敏度高,重复性好等特点,可准确测定市售奶粉中N-乙酰神经氨酸的含量。     

肉制品中唾液酸含量和形态分析及在加工中的变化

本文主要运用了高效液相色谱法测量了我国牛肉、猪肉等常见肉类及常见熟食制品如火腿、香肠、卤牛肉、风干羊肉、香辣鸭脖中的两种唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（N-Glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）、N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic acid,Neu5Ac）的含量、存在形式以及不同加工方式对其含量及存在形式的影响。结果表明红肉中Neu5Gc含量：牛肉46.57±2.53 μg/g>猪肉28.69±1.03 μg/g>羊肉29.09±2.32 μg/g,红肉中同时含有结合态Neu5Gc和游离态Neu5Gc,结合态Neu5Gc含量普遍高于游离态Neu5Gc。红肉中Neu5Ac含量：羊肉200.15±24.96 μg/g>猪肉110.89±5.71 μg/g>牛肉80.97±5.60 μg/g。白肉中不含Neu5Gc,鸭肉的Neu5Ac含量最高,为185.73±23.11 μg/g。熟食肉制品中,牛肉制品的Neu5Gc含量仍高于其他红肉熟食制品,并在白肉熟食制品中检测出了Neu5Gc的存在。对红肉进行蒸煮、油炸及腌制处理后Neu5Gc和Neu5Ac含量都有所下降,其中经过油炸处理的样品Neu5Gc和Neu5Ac含量下降最为明显,其次是腌制、蒸煮。本文还研究了蒸煮时间对猪肉中唾液酸含量的影响,即随着蒸煮时间的增加,Neu5Gc、Neu5Ac含量变化的总体趋势减少,蒸煮45 min后结合态唾液酸明显减少,游离态增多。即红肉中特异性含有Neu5Gc,白肉类熟食制品中也可能含有Neu5Gc,通过加工可改变肉制品中唾液酸的含量和形式,但是每种加工方式对于唾液酸含量及形式的改变不同。     

聚唾液酸的水解与唾液酸的纯化

在HPLC分析唾液酸质量分数的基础上,选择盐酸作为大肠杆菌发酵液中聚唾液酸的水解用酸.在85℃水浴.盐酸浓度为0.1mol/L的条件下,水解2h,水解率平均可达95%以上.水解液中和过滤后,用离子交换色谱分离与冷冻干燥得到唾液酸产品.质谱及HPLC分析证实所得产品中主要成分是N 乙酰神经氨酸,其纯度达96.4%.     

N-丙酰-唾液酸衍生物的化学酶法合成及在测定禽蛋中唾液酸含量的应用

为实现禽类蛋黄和蛋清中N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）的准确定量,消除禽蛋样品中分析物以外的物质产生的基质效应对分析结果造成的影响,本研究以甘露糖胺为底物采用化学酶法合成了非天然唾液酸衍生物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷-N-丙酰-唾液酸（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside-N-propionyl-sialic acid,X-Gal-α-2,6-Neu5Prop）,对该衍生物在酸性条件下的水解特性以及稳定性进行研究,并以该衍生物为内标测定了鹌鹑、鹅、珍珠鸡、鸵鸟、鸭、鸽子、火鸡等9种禽类蛋黄和蛋清中Neu5Ac的含量。禽蛋样品和内标物在酸性条件下处理,唾液酸糖缀合物被解离为游离的唾液酸后经荧光标记物邻苯二胺衍生,采用高效液相色谱-荧光检测器对样品进行分析。结果表明,相同浓度的X-Gal-α-2,6-Neu5Ac和X-Gal-α-2,6-Neu5Prop在2 mol/L的醋酸溶液80℃的水解条件下水解程度相当,90 min后能够完全转化为游离的唾液酸。Neu5Ac和Neu5Prop在10 h内仍保持相似的稳定性。蛋清中Neu5Ac的含量在不同物种之间表现出很大的差异。鹌鹑蛋清中Neu5Ac的含量最低（0.13 mg/g）,而鸵鸟蛋清中的最高（2.20 mg/g）,比鹌鹑蛋清Neu5Ac含量高出近17倍。该方法能够消除生物样品中的基质效应,实现对Neu5Ac的准确定量,且样品前处理简单。因此,适合常规食品中Neu5Ac的检测与分析。     

高效液相色谱-荧光检测法测定红肉及其加工肉中唾液酸含量

采用高效液相色谱-荧光检测法对红肉及其加工肉中两种唾液酸N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）进行定性和定量分析。利用单因素试验对衍生化与样品酸解条件进行优化,并借助超声缩短酸解时间。结果表明,以盐酸作为酸解试剂,超声辅助酸解30 min,4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐作为衍生化试剂,衍生化试剂浓度为13 mmol/L,样品与衍生化试剂比值为1∶1,衍生化时间120 min时,检测效果最佳。Neu5Ac和Neu5Gc在0.1～10 μg/mL范围内线性良好,回收率为91.2%～119.7%,检出限分别为0.003 mg/kg和0.01 mg/kg,重复性的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为0.7%～1.8%,精密度RSD分别为1.4%和1.2%。本方法具有灵敏度高、分析时间短、重复性及准确性好等特点。     

脱乙酰甲壳质在医药中应用的最新进展

脱乙酰甲壳质(chitosan，又称壳聚糖，甲壳胺，壳多糖，几丁聚糖等)是甲壳质(chitin)脱乙酰基后得到的水溶性衍生物。甲壳质广泛存在于节肢动物如虾和蟹的外壳以及昆虫如春蚕的体表层。它是由N-乙酰氨基葡糖通过β-1→4键连接起来的多糖，因不溶于水而限制了其应用。脱乙酰甲壳质的分子极性较甲壳质强，可     

气相色谱法同时测定多糖中的中性糖、糖醛酸、氨基糖和唾液酸

采用甲醇解和硅烷衍生化,用气相色谱法同时测定样品中的中性糖、糖醛酸、N-乙酰氨基糖和唾液酸,取得了很好的效果。3种标准单糖混合物(包含阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰半乳糖、N-乙酰葡萄糖、5-乙酰唾液酸)和2种多糖样品(豆腐渣多糖DFP、鸡腿菇多糖F32)用1 mol/L盐酸甲醇在85℃反应18～24 h,碳酸银中和,加入乙酸酐室温暗处反应24 h,使氨基糖重新引入N-乙酰基,除银盐,干燥,加入硅烷化试剂[V(吡啶)∶V(六甲基二硅氨烷)∶V(三甲基氯硅烷)=5∶1∶1),室温放置30 min,最后用气相色谱进行分析。