高纤溶活性纳豆食品的研究

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,我们从酱豆、豆豉及纳豆中分离和筛选到5株有明显纤溶活性的芽孢菌株,其中NK-5菌株活性最高,故被用作纤溶活性纳豆生产菌。根据形态和生理生化特征以及DNA中G C含量,鉴定NK-5菌株为枯草杆菌(Bacillus substilis),该菌株的重要特点是产生强力纤溶酶和大量胞外粘质。后者经鉴定为r-多聚谷氨酸。用NK-5菌株试制的纳豆既有日本纳豆典型的感官特征和营养组成,还具有很高的纤溶活性,其酶活性在贮存中能保持稳定,故有很高的利用价值,可望开发成新型保健品。     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

纳豆激酶高产菌的快速筛选及其发酵纳豆特性

通过纤溶活性筛选法和纳豆激酶基因筛选法,快速、准确筛选到一株纳豆激酶高产菌株MJ-1,经16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。以黄豆为原料进行固体发酵制备纳豆食品,考察了纳豆食品的纳豆激酶活力、抗凝活性和抗氧化活性。在初始含水量60%、发酵温度37 ℃的条件下,纳豆激酶发酵活力在20 h达到最大值（90.18 FU/g,以干质量计）,达到了商业化纳豆的酶活力水平。抗凝活性分析显示该菌株可合成抗凝成分,赋予纳豆食品抗凝活性,在提取物质量浓度为3 mg/mL时,抗凝效率达91%。同时,与未发酵黄豆相比,发酵过程显著提高了其抗氧化活性。     

纳豆菌的定向筛选及其生物学特征分析

目的从日本成品纳豆中筛选蛋白酶活性高、溶血栓活性显著的纳豆菌,并对筛选获得的菌株进行生物学特征分析。方法用梯度稀释法分离单菌落,然后根据所筛选菌株具有革兰氏染色阳性、淀粉酶活性、高蛋白酶活性、高纤溶酶活性等特征设计纳豆菌株的定向筛选方案。结果获得2株高蛋白酶活性、高纤溶酶活性的纳豆菌BN9和BN23;BN9液体培养物在接种后12 h进入对数生长期,24 h时菌体浓度和蛋白酶活性均达到最高,且生长延滞期的菌体呈长链状结构,对数生长期后期的菌体开始断裂为短杆状。结论采用定向筛选方案获得高溶血栓活性纳豆菌株的方法可行。     

产纤溶酶菌株的分离和鉴定及纤溶酶基因在酿酒酵母中的表达

目的:从豆豉中分离具有强纤溶活性的菌株,实现纤溶酶基因在酿酒酵母中的表达.方法:通过纤维蛋白平板法从豆豉中分离具有强纤溶活性的菌株,结合形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定该菌株;通过PCR扩增豆豉纤溶酶基因,构建pYES2-DFE重组质粒,转化酿酒酵母H158感受态细胞,经β-半乳糖诱导表达后,用纤雏蛋白平板法分别检测发酵液上清和菌体破碎上清的纤溶酶活性.结果:鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);活性检测结果是酿酒酵母发酵液上清具有纤溶酶活性,而菌体破碎上清没有活性.结论:豆豉纤溶酶基因在酿酒酵母中实现了分泌表达.     

传统调味品中纳豆激酶产生菌的筛选和鉴定

为开发符合中国人口味的纳豆,以传统调味品豆豉和豆酱为样品来源,筛选酶活高和发酵性状优良的纳豆激酶产生菌。分别利用牛奶平板和琼脂糖-纤维蛋白平板进行初筛和复筛;对筛出的菌进行纳豆激酶活性分析、纳豆制作及感官评价等。对性状优良的菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等项目的测定;并对其培养基初始pH、发酵温度、盐离子构成等条件对酶活的影响进行单因素分析。结果共分离到15株具有纤溶活性的纳豆激酶产生菌,经计算,从中选出了4株高活力纳豆激酶产生菌(N-1,N-2,N-3,N-4菌株)。N-2菌株纤溶活性最高,其纳豆发酵性状最佳,纳豆拉丝长达80cm,其酶活达到1159U/mL,鉴定结果是该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌最适的单因素液体发酵条件为:培养基初始pH 6.0,添加0.02%浓度的Ca2+盐,发酵温度35℃。在该条件下进行液体发酵,其酶活为1365U/mL,酶活比之前提高了18%。N-2菌株发酵性状优良,可用于纳豆制作。     

具纤溶活性菌株ND2的筛选及其纳豆激酶基因的克隆、表达

从市售的纳豆制品中分离并纯化出一株具有高效纤溶活性的菌株ND2,经生理生化特性及16SrRNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌。通过正交试验优化菌株ND2的发酵条件,得到ND2产纳豆激酶的最佳条件:氮源-大豆蛋白胨,碳源-淀粉,碳氮比3:1,37℃,pH6.0。经PCR扩增得到825bp的纳豆激酶成熟肽基因,采用pET32a(+)表达载体和BL21(DE3)为宿主菌,在温度为37℃、1‰IPTG浓度下可诱导获得较高表达量的重组纳豆激酶。     

纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取液、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶活性进行研究。结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6~10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,对能产生纳豆激酶的菌株进行了分离筛选,得到了具有较高纤溶活性的四株,考虑到发酵后的纳豆感官,我们最终选择编号为4411、465的菌株作为生产用菌种.根据其形态、生理生化特征以及与枯草芽孢杆菌的比较,初步判断这两株菌株为枯草茅孢杆菌（Bacillus subtilis）.     

微生物产物溶解纤维蛋白活性测定方法的比较

纤维蛋白是血栓的主要组成部分,溶栓药物能溶解血栓主要是溶解血栓中的纤维蛋白。现在广泛研究的纳豆芽孢杆菌之所以具有较强溶血栓的功能主要是它能溶解血栓中的纤维蛋白的原因。比较了两种测定具有溶解纤维蛋白活性(以下简称“溶纤)”菌株活性的方法,从而为筛选具有高溶纤活性菌株提供简易的方法。     

纳豆激酶高活性菌株的筛选及其发酵条件的优化

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,从24种豆制品中分离和筛选出3株有明显纤溶活性的芽孢杆菌菌株,其中BN-6菌株活性最高,达到900U/ml。通过单因素试验和正交实验确定了液体发酵纳豆激酶最佳条件培养液中豆粕粉2%,玉米粉1%,初始pH=6.5,温度37℃。     

紫外分光光度法测定纳豆激酶体外纤溶活力

建立短时间、定量测定纳豆激酶体外纤溶活力的方法。在体外反应体系中制备血纤维蛋白底物,向体系中加入待测样品(纳豆激酶),进行纤溶反应。用紫外分光光度计测定纳豆激酶水解纤维蛋白后生成的可溶性产物的吸光值。由此对纳豆激酶体外纤溶活性进行定量测定并进行方法可行性分析。该方法具有较好的灵敏度、精密度和准确度,用时短,该方法适用于纳豆激酶体外纤溶活性的定量分析。     

溶栓纳豆芽孢杆菌的筛选鉴定及产纳豆激酶条件的研究

利用目标纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)所应具有的耐热性、耐盐性、显著的蛋白酶活性及生物素缺陷等生物学特性,设计了定向选育方案,从日本传统食品纳豆中筛选出具有较高纤溶活性的8株枯草芽孢杆菌,命名为 NK-1～NK-8；根据菌落形态、生理生化特征,鉴定为纳豆芽孢杆菌。NK-4菌株经过发酵培养,液体培养指数生长期为4～12h,最佳产酶条件是 pH7．0,培养温度34℃,装液量100mL/500mL。     

豆豉来源的纤溶酶产生菌株的筛选及发酵性能研究

采用酪蛋白平板初筛的方法,从豆豉中分离到278株具有蛋白酶活力的菌株,经过纤维蛋白培养平板复筛,并获得1株产纤溶酶能力较强的菌株,命名为LZ-238。在对LZ-238菌株常规形态学及生理生化特性鉴定的基础上,对部分长度的16SrDNA同源性进行了分析,发现LZ-238菌株与地衣芽孢杆菌相似度达99.5%,命名为Bacillus amyloliquefaciens LZ-238。通过液体发酵及阿胶纳豆的制作,对LZ-238菌株产酶及应用性能进行了评价。经发酵,LZ-238菌株纤溶酶的最高产量可达28.12U/mL,其制作的阿胶纳豆具有豆豉的特有香气且几乎无氨味,更符合中国人的口味。     

枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶特性分析

分离鉴定溶栓酶高产菌株,对其所产溶栓酶的类型、相对分子质量及发酵曲线进行特性分析。从中国豆豉中分离一株纤溶酶高产菌株MX-6,经个体形态、菌落形态及16S r DNA基因同源性比对,确定该菌株为枯草芽孢杆菌。应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)克隆到1 473 bp的纤溶酶编码基因apr N,根据推测氨基酸序列与同源序列的多序列比对及系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-polyacrylamide gels electrophoresis,SDS-PAGE)确定枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的相对分子质量约28 ku,与预测的相对分子质量27 712. 72 u相吻合。枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的发酵曲线结果显示在72 h达到纳豆激酶最大合成量,在纤维蛋白平板上的溶圈直径高达21. 60 mm。为更好地实现纳豆激酶的开发及应用提供一定的理论依据和方法参考。     

豆豉中纳豆芽孢杆菌的筛选及其发酵工艺的研究

利用纤维蛋白平板法,从我国传统食品豆豉中筛选出1株具有高纤溶活性的纳豆芽孢杆菌菌株NK-1.通过单因素试验和正交试验确定了该菌株液体发酵最佳条件:大豆蛋白胨1.0.%,萄糖2.0%,培养温度35℃,初始pH值为7.0,培养时间72h时,该菌产酶纤溶活力可达1225.5尿激酶IU/mL.     

纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究

经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶,纯化倍数15.6,回收率10.2%,SDS-PAGE电泳显示为二个组分,分子量在29000左右。对其纤溶性质研究表明:纳豆激酶活性的最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆生理盐水浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

纳豆激酶制剂的研究

以选取的纳豆菌-9号为出发菌株，在最佳摇瓶培养条件基础上通过5L发酵罐扩大培养，确定最优发酵培养条件，纳豆激酶活力较摇瓶培养提高2．05倍；发酵液经真空冷冻干燥得到纤溶活性较高的纳豆激酶干粉，并对纳豆激酶干粉的部分酶学性质进行了研究。     

纳豆激酶液体发酵技术研究进展

纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶,与传统的一些溶栓剂相比,其具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血,纤溶活性强,作用时间长等优点。有望被开发为新一代的口服抗血栓药物。现就纳豆激酶的结构、性质、功能以及开发现状和应用前景等方面进行了综述。     

纳豆菌分离、鉴定及纳豆激酶高产菌株的正向选育

从日本纳豆食品中分离到1株枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)Bs01-1菌株,根据纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶与蛋白酶活性的正相关关系,采用紫外线直接照射涂菌蛋白平板进行诱变育种的,成功地筛选到2株突变株MBS04-6和MBS04-9,其溶纤活性分别比出发菌株提高了87%和69%,达到4 179 IU/mL和3788 IU/mL。该法筛选菌株的正向突变率达到10%。