利用牡蛎制备DPP-IV抑制肽及其活性分析

以牡蛎肉为原料制备二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV,EC 3.4.14.5）抑制肽。通过对比5 种蛋白酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶）制备的酶解液对DPP-IV的抑制活性,发现胰酶制备的酶解液对DPP-IV抑制效果最好。通过优化胰酶酶解条件,确定最优酶解条件为加酶量0.8%、pH 8.0、温度37 ℃,酶解时间90 min。酶解液经超滤、Sephadex G-15和高效液相色谱分离纯化,获得肽片段。通过质谱鉴定筛选得到2 种肽段的序列为Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys（EITALAPSTMK）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER）。利用BIOPEP在线模拟分析了这2 个肽的胃肠液消化特性。采用固相合成法合成肽段APSTM和ILAPPER,并应用于DPP-IV抑制活性研究。结果显示,2 个肽段的IC50值分别为354.81 μmol/L和16.98 μmol/L。分子对接结果表明,抑制肽与DPP-IV的活性部位主要以氢键、范德华力和π键相互作用为主。本研究通过酶解牡蛎肉制备高抑制活性的DPP-IV抑制肽,为以牡蛎为原料的功能性食品开发利用提供了理论基础。     

中国毛虾二肽基肽酶-IV抑制肽的分离纯化与结构鉴定

食源性二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)抑制肽有助于调节机体血糖。为实现中国毛虾的高值化利用，从中国毛虾酶解产物中制备DPP-IV抑制肽，使用动物蛋白酶水解中国毛虾，以DPP-IV抑制率为评价指标分离多肽，并通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明，酶解液经超滤、Sephadex G15和反相高效液相色谱分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后，得到了5条DPP-IV抑制肽，氨基酸序列分别为YGGQFPTRPD、PALPSIPH、IFTAPQVP、PAFPHPLP和LGDAPGEVP;其中PALPSIPH和PAFPHPLP对DPP-IV的抑制活性较高，二者的IC₅₀值分别为(2.68±0.06)和(1.61±0.06) mmol/mL。分子对接结果表明PALPSIPH和PAFPHPLP主要通过氢键与DPP-IV活性中心及其以外的位点相结合，以此达到抑制作用。该研究基于中国毛虾制备食源性DPP-IV抑制肽，为水产蛋白来源降血糖功能性食品开发利用和新型DPP-IV抑制肽的研究提供参考。     

酶解法制备鲟鱼皮活性肽条件优化及抗氧化能力

为提高从鲟鱼皮中提取的生物活性肽含量,以鲟鱼皮胶原蛋白为主要材料,以蛋白酶酶解后的肽得率为 主要考察指标,在单因素试验基础上利用正交试验分析加酶量、酶解温度、酶解时间对鲟鱼皮活性肽得率的影 响,并优化酶解条件。在此基础上以新鲜猪肉为模型,考察鲟鱼皮活性肽溶液处理对猪肉组织抗氧化酶（总超氧 化物歧化酶（total-superoxide dismutase,T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、 谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase,GST））活力的影响。结果表明：酶解鲟鱼皮胶原蛋白的最适 酶为碱性蛋白酶,最佳工艺条件为加酶量12 000 U/g、酶解温度60 ℃、酶解时间4 h,在此条件下,肽得率为 （12.59±0.98）%;鲟鱼皮活性肽可以提高猪肉组织T-SOD、GSH-Px和GST活性,具有抗氧化功效。     

马面鱼皮ACE抑制肽的制备、分离纯化及稳定性

为实现马面鱼皮的高值化利用,优化其胶原蛋白制备ACE抑制肽的酶解条件,通过超滤、凝胶色谱、高效液相及U-PLC-MS等方法分离、纯化及分析ACE抑制肽.探讨pH值、温度及体外模拟胃肠消化对分离制备多肽的ACE抑制活性的影响.结果表明:利用复合酶解法可制备高活性ACE抑制肽,即在蛋白酶N"天野"2G用量1200 U/g,...     

马氏珍珠贝来源DPP-IV抑制活性肽的虚拟筛选及其作用机制

为了快速发现马氏珍珠贝来源二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制活性肽,本研究利用数据库中20个已报道的DPP-IV抑制肽组成训练集,构建了药效团模型并通过测试集分子和Fisher随机验证法对模型进行了评估。利用在线网站PeptideCutter,以珍珠贝肉蛋白为原料,进行虚拟酶解。使用最优药效团模型（Hypo1）对虚拟酶解获得的192个低分子肽（氨基酸数小于或等于5）进行初步筛选,接着以分子对接的方法进一步筛选,并且对潜在的DPP-IV抑制活性肽进行固相合成,体外验证其活性并分析其作用机制。结果表明,药效团结合分子对接技术筛选了4个理论上可能具有高活性的DPP-IV抑制肽,即LPIY、VQDR、PIY和APSL。其中,VQDR、PIY没有表现出抑制活性,而LPIY和APSL具有较高的DPP-IV抑制活性,其IC₅₀值分别为521.19 和258.67 μmol/L。与DPP-IV相互作用的机理表明,肽LPIY和APSL与DPP-IV活性口袋中的氨基酸残基形成了多个氢键,且N-端第二个位置的脯氨酸（P）也均与活性口袋中的残基形成了Pi-Alkyl作用,因此促进了LPIY和APSL的DPP-IV抑制作用。本研究为高效筛选珍珠贝来源的DPP-IV抑制肽提供了理论方法。     

松仁清蛋白抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定

利用碱性蛋白酶酶解松仁清蛋白制备高抗氧化活性肽,通过超滤、SephadexG-25、SephadexG-15及反相高效液相色谱对抗氧化肽进行分离纯化,并采用电喷雾串联质谱进行结构鉴定。经筛选获得高抗氧化活性肽苯丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸（FFPY）和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸（YLPF）,分子质量分别为572.67 Da和538.65 Da。对FFPY和YLPF进行固相合成,纯度达到99.16%和99.91%,氧自由基吸收能力分别为7 329.63 μmol/g和2 835.47 μmol/g。     

酶解鸡血球制备抗氧化肽的工艺优化和分析鉴定

为挖掘家禽血液潜在的抗氧化特性,以鸡血球为原料,筛选最佳蛋白酶酶解制备抗氧化肽,并对酶解工艺进行响应面优化。采用超滤、阳离子交换色谱、凝胶色谱及高效液相色谱对酶解物进行连续分离纯化,并用质谱进行结构鉴定。结果表明,酸性蛋白酶水解血球蛋白制备的酶解物具有最高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力（＞80%）。其最佳酶解条件为酶用量2%、酶解温度45?℃、酶解时间3.0?h,该条件下的DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和还原力分别为（98.31±0.66）%、（28.89±0.31）%和1.94±0.03。经系列分离纯化获得抗氧化活性最强的组分,其在质量浓度为0.1?mg/mL时,DPPH自由基清除能力和还原力分别为（87.16±1.59）%和0.21±0.01。经高效液相色谱-质谱联用技术鉴定,目标肽的氨基酸序列为MGQKDSYVGDEAQSKRGILT,分子质量为2?182.1?Da。     

麦胚降血糖肽的分离纯化及鉴定

建立麦胚降血糖肽的分离纯化方法及鉴定活性多肽的结构组成。采用胰蛋白酶酶解麦胚蛋白,得到降血糖多肽,并进行降血糖动物实验。超滤获得高活性组分,离子交换吸附实验选择最佳的树脂,并对麦胚降血糖肽进行离子交换吸附分离,SephadexG-25和SephadexG-15分离,再经过反相高效液相色谱（reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC）分离高活性成分。最后采用高效液相色谱-电喷雾-质谱（HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry,HPLC-ESI-MS）鉴定活性多肽的结构组成。结果显示酶解麦胚蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制性IC50为10.98?mg/mL,能够缓解糖尿病小鼠的症状。超滤获得分子质量小于5?kDa的高活性组分,IC50为1.60?mg/mL。732型阳离子交换树脂的分离效果最好,2.5%氨水的洗脱率为98.13%,通过动态离子交换吸附分离后,活性显著提高,IC50为0.30?mg/mL。通过SephadexG-25和SephadexG-15分离得到高活性组分,经RP-HPLC分离得到8?个组分（峰）,其中1号峰的活性和含量都最高,IC50为0.098?mg/mL。HPLC-ESI-MS结果显示m/z?274.45的丰度比较高,经离子碎片拼接,共有7?种多肽,其中二肽有1?种,三肽有6?种。本研究对于开发具有降血糖功效的新型功能性食品有一定的作用。     

马氏珍珠贝软体酶法制备降糖肽的工艺优化及肽段分析

目的:以二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase，DPP-IV）抑制率和葡萄糖消耗量为指标优化马氏珍珠贝软体的酶解工艺，并对酶法制备的降糖肽进行分析。方法:以人肝癌细胞（HepG-2）胰岛素抵抗模型的葡萄糖消耗量、体外二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase，DPP-IV）抑制率为评价指标，比较筛选了酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶对马氏珍珠贝软体的酶解效果，通过单因素及正交试验分析酶解温度、料液比、加酶量、酶解时间等因素对酶解物降糖活性的影响，确定最佳酶解工艺，以液相串联质谱（Nano LC-MS/MS）分析酶解物中肽类物质组成。结果:酸性蛋白酶酶解的产物葡萄糖消耗量和DPP-IV抑制率优于其他种类蛋白酶，马氏珍珠贝软体制备降糖肽的最佳酶解条件为:45 ℃、3 h、料液比1:3.5（w:w）、加酶量1000 U/g，在此条件下的葡萄糖消耗量为37.53%、DPP-IV抑制率为74.21%。最佳工艺制备的马氏珍珠贝软体酶解物中93.88%的肽段分子量低于2000 Da，22.63%的肽段为疏水性肽段，74.92%的肽段N端至少有含有一个疏水性氨基酸。结论:本研究酶法制备的马氏珍珠贝软体降糖肽可通过抑制DPP-IV的活性及减少胰岛素抵抗发挥降糖作用，对功能食品的研发具有一定的指导意义。     

三斑海马蛋白ACE抑制肽的制备及其二级结构的研究

以三斑海马为原料,经碱性蛋白酶酶解,获得富含血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽的酶解液。酶解液经透析、Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱得到进一步分离纯化。结果表明,透析产物的IC50值为(0.44±0.26)mg/mL,相比酶解液(0.81±0.12)mg/mL,其ACE抑制活性更强。透析产物经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化后,得到3种组分,其中组分F2的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.11±0.08)mg/mL。F2经反相高效液相色谱进一步分离后,得到6个具有ACE抑制活性的组分峰,其中组分F2-4的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.005 7±0.000 9)mg/mL。经过3步分离纯化后,成功从三斑海马蛋白中分离得到一种活性较强ACE抑制肽:ProAla-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala(PAGPRGPA),多肽分子量为721.39 Da。圆二色谱分析多肽二级结构表明其主要含无规则卷曲。因此,从三斑海马蛋白中分离得到的多肽可能成为营养保健品和抗高血压药品及相关疾病的一种有益成分,且对海马蛋白资源的开发利用具有重要意义。     

海参二肽基肽酶Ⅳ抑制肽的酶解制备及结构鉴定

通过抑制二肽基肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV, DPP-IV)的活性,从而减少GLP-1的降解,提高血液中胰岛素的水平,是控制血糖水平的一种重要手段。本文以海参(Holothariatubulosa)为原料,通过探究蛋白酶种类、加酶量和酶解时间对酶解产物DPP-IV抑制活性、蛋白回收率和水解度的影响,确定了海参DPP-IV抑制肽的制备条件,并进一步测定了其分子量分布和总氨基酸组成,最后通过UPLC-MS/MS鉴定了其潜在的活性肽序列。结果发现,木瓜蛋白酶与复合蛋白酶1:1的复配酶解具有最佳的酶解效果,其产物的得率和DPP-IV抑制活性均最高,且在加酶量为干海参质量的1%,酶解时间为4 h时,海参酶解产物在终浓度为2 mg/mL时的DPP-IV抑制率为66.97%,蛋白回收率为76.25%,水解度为6.10%。酶解产物的分子量大都小于5000 u,且富含脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)等与抑制DPP-IV活性有关的氨基酸。将获得的酶解物中的肽段进行液质联用检测,并通过Mascot分析筛选得到28条具DPP-IV抑制肽的肽序列,分子量在500～1936 u。本实验结果为以海参为原料进行降血糖产品的开发奠定了基础。     

大米谷蛋白模拟酶解释放生物活性肽的研究

目的 通过对大米谷蛋白的模拟酶解及生物信息学分析, 评价大米谷蛋白作为生物活性肽前体的潜在价值。方法 首先, 利用计算机在UniProt蛋白质数据库中查找大米谷蛋白的序列, 使用BIOPEP活性肽数据库对所选的3条序列进行模拟酶解, 并同时对酶解产生的肽片段数量、分子量及其氨基酸组成进行统计分析。然后, 将模拟酶解产生的肽片段序列与BIOPEP数据库中已有记载的生物活性肽序列进行对比, 筛选出具有生物活性的肽片段。最后, 对模拟酶解产生的生物活性肽进行致敏性和毒性预测。结果 胃蛋白酶和木瓜蛋白酶是最适合水解大米谷蛋白的两种酶。大米谷蛋白酶解可产生许多生物活性肽, 其中出现频率最高的是二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV)抑制肽和血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制肽。大米谷蛋白本身无潜在致敏性, 且其经过计算机模拟酶解得到的DPP-IV抑制肽和ACE抑制肽均无细胞毒性。结论 大米谷蛋白可作为酶解释放DPP-IV抑制肽和ACE抑制肽的良好前体, 本研究为大米谷蛋白酶解生产生物活性肽提供了理论指导。     

青蛤多肽的酶法制备及对前列腺癌DU-145细胞的抑制活性

探讨青蛤多肽的制备工艺及体外抗前列腺癌DU-145细胞的活性。以氨基氮含量为检测指标,筛选最优酶种类并进行正交试验以获取最佳酶解青蛤内脏酶解工艺。经超滤截留、琼脂糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化及噻唑蓝（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）活性筛选得到含有5 个氨基酸的多肽（Ile-Leu-Tyr-Met-Pro）。对所得多肽采用MTT法测定DU-145细胞增殖抑制率;采用倒置显微镜、Hoechst 33258染色及透射电子显微镜技术观察细胞形态学变化;采用荧光法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;采用线粒体膜电位检测DU-145细胞凋亡情况;采用免疫组织化学法检测非转移性克隆23型（nm23H1）蛋白的表达。结果表明：制备青蛤多肽最佳酶是木瓜蛋白酶,最佳酶解条件是料液比1:4、pH 7.0、加酶量1 500 U/g、温度45.0 ℃、酶解时间4 h;所得多肽对DU-145细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈时间与剂量依赖性;处理后的DU-145细胞出现凋亡的形态学特征;其质量浓度和细胞内ROS的表达量呈正相关关系;线粒体膜电位降低率从4.22%提高到25.07%;免疫组织化学法结果显示nm23H1蛋白的表达量增加。青蛤多肽能明显抑制DU-145细胞的增殖,并通过诱导其发生凋亡而发挥作用。     

酸处理对酶法提取鲟鱼皮胶原多肽的影响

以人工养殖的鲟鱼鱼皮为研究对象,通过单因素实验比较乳酸、柠檬酸、乙酸对酶法提取鲟鱼皮胶原多肽的影响,并考察了酸溶胀浓度、溶胀固液比、溶胀时间及溶胀温度对其的影响。在此基础上利用正交实验对提取鲟鱼皮胶原蛋白肽的酸处理工艺进行优化。结果表明,采用溶胀酸为乳酸,在质量浓度为3%,溶胀固液比为1∶5,溶胀时间为2h,溶胀温度为30℃的条件下,鲟鱼皮胶原蛋白肽的水解度为43.58%,短肽得率为55.84%,水解度比不经酸溶胀的要高出23.08%。     

红岛蛤蜊肉酶解工艺优化及其产物降血压功能研究

以营养价值较高且具地域性特色的红岛蛤蜊为研究对象,以水解度为指标,比较了复合蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶对蛤蜊肉的酶解效果。结果表明,复合蛋白酶的酶解效果优于其他蛋白酶。选用复合蛋白酶,通过酶解温度、pH、料液比、加酶量、酶解时间的单因素实验以及正交试验确定蛤蜊肉酶解的最佳工艺条件为:酶解温度58 ℃、酶解时间6 h、初始pH7.0、料液比1:2（g:g）、加酶量1000 U/g,在此条件下的水解度达71.03% ± 0.69%。通过高效液相测定蛤蜊肽的分子量分布,得出相对分子质量小于1000 Da的占比为94.29%。对蛤蜊肽进行降血压活性研究,结果显现了良好的血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性,其IC₅₀=0.67 mg/mL。本研究结果为红岛蛤蜊的精深加工和利用提供了理论依据。     

微波辅助分步酶解紫苏饼粕蛋白制备鲜味肽

在微波辅助的条件下,利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶分步对紫苏饼粕蛋白进行水解,应用正交试验确定了最佳的酶解条件。通过Sephadex G-15凝胶层析、反相高效液相色谱(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法和电子舌技术对酶解液成分与鲜味的变化进行了表征。结果表明,在微波功率400 W条件下,第1步碱性蛋白酶最佳酶解条件为酶添加量1 600 U/g、p H 10.0、微波温度60℃、微波时间35 min;第2步风味蛋白酶的最佳酶解条件为酶添加量1 600 U/g、p H 6.5、微波温度65℃、微波时间40 min,分步酶解最终水解度为44.86%。最后通过凝胶层析、RP-HPLC与电子舌表征,证明微波辅助分步酶解法快速、高效,且与单独酶解所得产物相比,其产物鲜味改善明显。     

青鱼肉活性肽的制备及其抗肿瘤活性研究

以青鱼肉为原料,经二步酶解、凝胶色谱分离纯化制备抗氧化和抗肿瘤活性肽。首先以抗氧化活性和水解度为评价指标,采用单因素和正交试验优化青鱼肉活性肽的制备工艺;然后采用凝胶色谱进行分离纯化,得到不同分子质量多肽组分并分析其氨基酸组成、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力和抗肿瘤活性。结果表明,二步酶解青鱼肉的最优酶解组合为碱性蛋白酶-复合蛋白酶,最佳制备工艺为:pH 8.00、酶解温度50℃、料液比2∶10(g∶mL)、酶添加量6000 U/g、酶解时间3 h,在此条件的二步酶解物清除DPPH自由基的半抑制浓度(half inhibiting concentration,IC 50)为9.52 mg/mL;经Sephadex G-15分离得到5个肽组分,其分子质量范围为130~1397 Da;抗氧化实验表明,组分IV具有最强的DPPH自由基清除能力,其IC ₅₀为3.17 mg/mL,为二步水解物的3倍。细胞增殖抑制实验发现,10 mg/mL组分IV对HepG 2细胞抑制率为92.54%,表明青鱼肉活性肽同时具有抗氧化和抗肿癌活性。