海藻糖合酶基因工程菌的高密度发酵策略

探讨海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵过程中的一些影响因素,为海藻糖合酶基因工程菌实现工业化生产提供理论依据.     

海藻德合酶基因工程菌诱导表达条件的研究

实验将构建后的重组质粒pET21TreS转入大肠杆菌Rosetta gami(DE3)中,得到海藻糖合酶基因工程菌,并通过对培养时间、温度及诱导剂浓度等条件的优化,对其进行诱导表达,得到了该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌体浓度(OD_(600))至0.6～0.8时,以1mmol/L浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTC),37℃,诱导2h后得到的蛋白表达量较高.     

耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化

本文对植酸酶毕赤酵母基因工程菌PEY-2的发酵条件进行研究,结果表明:其摇瓶最佳产酶条件为诱导时间72h,诱导前适宜增殖时间48 h,接种量10％,种龄24h,诱导初始pH 6.0,生长阶段初始pH 5.5.在此基础上进行了50 L罐的发酵中试,50 L罐诱导产酶量达5.0×103 IU/mL,实现了高密度发酵.热稳定...     

表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因工程菌发酵条件的研究

研究表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因工程菌的发酵条件.利用250mL三角瓶发酵,对携带磷脂酰丝氨酸合成酶基因重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究培养基的pH值、装液量、转速、诱导时菌体浓度、诱导剂浓度、诱导时间和温度对磷脂酰丝氨酸合成酶酶活的影响.确定工程菌的最佳发酵条件为:培养基pH值为7.5,装液量为40mL,转速为200 r/min,诱导时菌体浓度为A600≈0.4,诱导剂蔗糖的终浓度为60 mmol/L,诱导时间为27h,诱导温度为37℃.在最佳发酵条件下,酶活可达2.56U/mL,是优化前的1.72倍,为中试放大提供了理论依据.     

产β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其发酵条件优化

构建β-苯丙氨酸变位酶基因表达重组质粒pET-28apam,并转化大肠杆菌BL21,获得β-苯丙氨酸变位酶基因重组菌。考察培养基初始pH、摇床转速、种龄、发酵时间以及装液量5个因素对β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌产酶活性的影响,确定较佳发酵条件为:培养基初始pH 7.0、摇床转速200r/min、发酵时间24h、装液量50mL/500mL、种龄10h。采用Box-Behnken试验设计,选择了种龄、初始pH、发酵时间3个对β-苯丙氨酸变位酶活力影响较大的因素进行响应面优化。优化结果为:在种龄12.8h、初始pH 6.7、发酵时间25.2h条件下,PAM活力达到11.15 U/mL,比优化前酶活4.87U/mL提高了128.9%。     

重组大肠杆菌生产海藻糖合酶发酵工艺优化

为了实现来源于嗜热栖热菌的海藻糖合酶的高效表达,对E.coli BL21(DE3)/p ET24a(+)-Tre S基因工程菌在3 L发酵罐进行了发酵工艺优化,获得的最优发酵条件为:诱导温度32℃,当OD600达到50时以0.2 g/(L·h)的速率补加乳糖进行诱导产酶,在该条件下发酵35 h时酶活达到472 U/m L,是优化前的2.3倍;进而采用该条件在30 L发酵罐进行了初步放大研究,酶活达到356 U/m L。由于该海藻糖合酶热稳定性好,因此尝试了高温处理破碎E.coli细胞以释放海藻糖合酶,结果表明,80℃处理30 min,海藻糖合酶的得率可达72.3%,具有工业化应用前景。     

响应面法优化大肠杆菌产海藻糖合酶发酵培养基

以海藻糖合酶基因工程菌E.coli BL21(p ET15b-Tre S)为研究对象,以海藻糖合酶的酶活为考察指标,对海藻糖合酶基因工程菌E.coli BL21(p ET15b-Tre S)的培养基进行优化。首先运用单因素实验对大肠杆菌(E.Coli)产海藻糖合酶进行了优化,利用Plackett-Burman进行两因素两水平设计对影响其产酶因素进行评估并筛选出具显著效应的3种因素:葡萄糖、酵母浸粉和K2HPO4。用最陡爬坡实验逼近以上三种因素的最大响应面区域后,采用Box-Behnken进行三因素三水平的设计以及响应面分析,获得最佳产海藻糖合酶的培养基。结果表明,发酵大肠杆菌的最佳培养基配方为:葡萄糖7.2g/L,酵母浸粉6.6g/L,蛋白胨10g/L,(NH4)2SO45g/L,K2HPO415.7g/L,KH2PO44g/L,Mg SO4·7H2O1.6g/L,微量元素混合液0.5m L/L。在此条件下进行产酶重复实验5次,海藻糖合酶酶活为65U/mg,比优化前提高了91.2%。     

嗜热放线菌海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

海藻糖合成酶可将麦芽糖异构化为海藻糖,是海藻糖酶法生物转化的中心酶制剂。为了实现海藻糖合成酶在食品安全型表达宿主中高效生产,进而应用于食品级海藻糖的酶法合成,构建了革兰氏阳性菌重组表达质粒并转化入地衣芽孢杆菌。重组质粒携带了来自于嗜热放线菌Thermomonospora curvata海藻糖合成酶的编码基因,在地衣芽孢杆菌木糖异构酶启动子及其阻遏蛋白的介导下表达,胞内海藻糖合成酶发酵活力为12.1 U/m L。考察了不同培养条件对重组菌生长和产酶的影响,结果显示质量分数4%的麦芽糊精和质量分数0.4%的豆饼粉分别为产酶适宜的碳源和氮源;菌体培养10 h后加入终质量浓度为1 g/d L的诱导剂,于37℃诱导12 h后重组菌产酶最高达到23.7 U/m L。     

耐热过氧化氢酶基因工程菌的构建及其发酵条件

利用PCR扩增技术以嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001染色体DNA为模板，扩增得到嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶编码基因perA。再与经EcoRⅠ酶切的温控表达载体pBV220连接，构建重组质粒，并转化宿主大肠杆菌JM109，得到耐热过氧化氢酶基因工程菌，然后对该工程菌在LB培养基和半合成培养基中的发酵条件进行了优化。结果表明：在LB培养基中，诱导时期和酶合成最佳诱导时间均为5h，最大产酶量达到72．9U／mL；在半合成培养基中，于30℃培养4h，再于42℃诱导培养6h，产酶量最高达到131U／mL。     

IGF—I工程菌的高密度发酵与工艺优化

为研究表达重组IGF—I（人胰岛素样生长因子-I）工程菌的优化发酵工艺条件,考察了3种不同培养基以及诱导时机、诱导剂量和诱导时间对蛋白表达的影响,用5L自控发酵罐进行分批补料培养实验,确定高密度发酵工艺条件。结果表明,以2×YT＋0．5％葡萄糖为发酵培养基,经0．8mmol/LIPTG诱导5h,通过控制溶解氧以及pH反馈补料方式,发酵液最终菌体密度达到OD650 21．7（菌体50．1g／L）,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30％。建立了该工程菌优化的高密度发酵工艺,为IGF—I的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

重组大肠杆菌P84A/MC1061诱导和表达卤醇脱卤酶的条件优化

考察重组工程菌E.coli P84A/MC1061的生长特性,并优化其在卤醇脱卤酶表达过程中的诱导条件和培养条件。在摇瓶发酵中,以阿拉伯糖诱导重组大肠杆菌P84A/MC1061表达卤醇脱卤酶。重点研究培养温度、装液量、摇床转速、培养基初始pH值、诱导时机、诱导剂添加量、诱导剂作用时间对卤醇脱卤酶的表达影响。在培养温度为30℃,装液量为25mL/250mL,摇床转速为200r/min,初始pH值为7.1时,当菌体量OD600值达到2时,按照1‰体积比添加L-阿拉伯糖,诱导培养22h后,发酵液OD值达到21.3,酶活力达到138555.3U/mL。研究发现,培养温度和初始pH值是基因工程菌E.coli P84A/MC1061诱导表达卤醇脱卤酶的显著影响因子,可为卤醇脱卤酶发酵生产的深入研究提供依据。     

一株黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L- 缬氨酸积累

从谷氨酸棒杆菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032 中克隆出L- 缬氨酸合成途径上的限速酶--乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN 进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌- 黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10 为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B. flavum ATCC14067,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L 罐发酵实验结果显示：在野生型菌株发酵液中检测不到L- 缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L- 缬氨酸积累达5.0g/L。     

基于DO-stat流加培养控制的海藻糖合成酶发酵条件研究

溶氧浓度对重组大肠杆菌的生长和外源蛋白的高效表达影响较大,为进一步增加菌体量和重组蛋白表达量,该研究采用DO-stat流加培养进行控制,分别研究了溶氧浓度20%、30%、35%和40%条件下大肠杆菌的生长情况以及海藻糖合成酶的表达情况。结果表明,当发酵罐中溶氧浓度控制在30%时,发酵40 h,菌体干质量可达53.9 g/L,是分批发酵时的6倍,海藻糖转化率达到80.9%,是分批发酵时的2.25倍。     

植物乳杆菌ZJ316高密度发酵条件优化

以1株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZJ316为研究对象,在MRS液体培养基的基础上,以吸光度值（OD600 nm值）为响应值,通过单因素试验及响应面试验对其高密度发酵培养基组分和培养条件进行优化。结果表明,L. plantarum ZJ316高密度发酵的最优培养基组成为蔗糖43 g/L、玉米浆干粉60 g/L、Na2HPO4-柠檬酸0.12 mol/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 0.10 g/L、吐温80 1 mL/L;最优发酵条件为接种量4%、发酵温度30 ℃、初始pH值6.5。在此优化条件下,采用发酵罐静置发酵24 h,植物乳杆菌ZJ316的OD600 nm值为5.13,活菌数可达8.01×109 CFU/mL,较优化前分别提高1.65倍、3.44倍。     

海藻糖合成酶基因工程菌玉米浆培养基配方优化

以玉米浆作为重组大肠杆菌培养基的主要碳源和氮源,在单因素优化的基础上,选择玉米浆、MgSO4和微量元素3个因素对玉米浆培养基进行响应面设计,采用BoxBehnken试验设计和响应面分析法,确定基因工程菌最佳的玉米浆培养基配方。结果表明,最佳的玉米浆培养基配方为:玉米浆26g/L,MgSO42.1g/L,微量元素7mL/L。该条件下,重组大肠杆菌产海藻糖合成酶酶活达到120.5U/mL。试验证明了玉米浆作为重组大肠杆菌培养基唯一的碳源和氮源生产海藻糖合成酶的可行性。     

蜂花粉的固态发酵工艺

采用乳酸菌、纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母对蜂花粉进行单菌、混菌固态发酵。结果表明,花粉发酵最适菌株为纳豆芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌,以1∶1的比例进行混菌发酵;接种方式先接纳豆芽孢杆菌,发酵3d后接嗜酸乳杆菌发酵5d,接种量为10%,发酵方式为浅层好氧发酵,花粉最适含水量为35%～40%,发酵温度为30℃。发酵后的花粉气味鲜香,口味酸甜,能克服天然蜂花粉口感和风味差的缺陷,是一种兼具花粉与益生菌双重保健作用的新型发酵花粉产品     

动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002发酵条件优化

为实现动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-002的高活菌数培养,获得其生长的最适发酵条件,对发酵工艺和发酵培养基分别进行优化。以菌泥收率为考察指标,通过单因素及正交试验对培养温度、接种量和初始pH值等发酵工艺参数进行了优化;以发酵液活菌数为响应值,通过单因素试验和Box-Behnken试验优化发酵培养基。结果表明,动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002最佳发酵条件为：培养温度39 ℃、接种量3%、初始pH值为7.2;最佳发酵培养基组分为：酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此优化条件下,菌株HCS04-002菌悬液活菌数达2.73×109 CFU/mL。     

从头合成赤松素大肠杆菌工程菌的构建

赤松素是高价值芪类保健营养品白藜芦醇的类似物,具有预防心血管疾病、抗癌和治疗关节炎等与其相对应的多种生物活性。本研究采用基因工程手段创制出一种从头生物合成赤松素的方法,以缓解目前赤松素供求不足的问题。把带有苯丙氨酸解氨酶(PAL),肉桂酸辅酶A连接酶(4CL)和赤松素合酶(STS)编码基因的组成型表达载体转化高产L-苯丙氨酸大肠杆菌ATCC31884,并通过PCR鉴定后,获得重组工程菌株。工程菌进行摇瓶培养,对培养液进行高效液相色谱检测,确定工程菌具有生物合成赤松素的能力。随后通过对工程菌在不同培养时间产物生成量的比较,结果表明,赤松素在发酵12 h后增长缓慢,24 h培养液中的赤松素含量最高,为0.32 mg/L,而其中间体肉桂酸的积累最高达到52.92 mg/L。这表明,大肠杆菌工程菌能在不添加任何前体物的情况下,利用自身代谢从头合成赤松素,但中间体肉桂酸的转化能力不足,有待下一步实验进行改善。     

人肠道来源霍氏肠杆菌4-2-1的分离及其对枸杞多糖的发酵作用

为了阐明肠道细菌在枸杞多糖吸收过程中的作用,本论文主要针对1株从人体肠道粪便中分离到的细菌进行研究,并将该菌株用于枸杞多糖发酵,并以发酵中细菌总数、pH、多糖含量、还原糖含量和分子量为指标反映发酵特性,初步阐明了枸杞多糖的消化和吸收。结果表明,通过形态学观察和分子生物学鉴定,该菌株为肠道单菌霍氏肠杆菌4-2-1（Enterobacter Hoechnii）,为革兰氏阴性菌,且该菌在发酵到12 h细菌总数达到最大,发酵后,培养基的pH由7.98变为7.75、多糖含量由682 μg/mL变为205.7 μg/mL、还原糖含量由225 μg/mL变为91.32 μg/mL,分子量由8.02 kDa变为3.44 kDa。结果发现,枸杞多糖在经过霍氏肠杆菌发酵后,多糖含量下降为原来的30.2%左右,还原糖含量下降为40.6%左右,分子量下降为42.9%,说明肠道菌能发酵利用枸杞多糖,研究为进一步研究多糖和肠道菌的相互作用提供依据。