不同水产品中有色和无色孔雀石绿的降解动力学研究

目的 研究不同水产品基质中有色和无色孔雀石绿的降解规律。方法 样品经提取净化后, 用HPLC进行检测, 结果用SPSS软件、降解动力学软件进行分析。结果 三种基质中有色和无色孔雀石绿降解反应均符合准一级反应动力学。在10、50、100 μg/kg三个添加水平下, 三种基质中有色孔雀石绿平均降解率分别为57.9%、48.0%、23.0%, 无色孔雀石绿平均降解率分别为46.6%、43.4%、19.8%。添加浓度为50 μg/kg的鲤鱼基质, 采用自然解冻时有色和无色孔雀石绿降解速率常数分别为K(50 μg/kg)=0.00338 d?1, K(50 μg/kg)=0.00268 d-1, 采用微波解冻方式时有色和无色孔雀石绿降解速率常数分别为K(50 μg/kg)=0.00359 d?1, K(50 μg/kg)=0.00321 d?1。实际样品中无色孔雀石绿降解速率常数K(111.2 μg/kg无色, 鲤鱼)=0.000614 d?1, K(50 μg/kg无色, 鲤鱼)=0.00125 d?1。结论 有色孔雀石绿较无色孔雀石绿降解快, 低浓度比高浓度降解快; 两种解冻方式对有色和无色孔雀石绿降解影响较小; 实际样品中无色孔雀石绿降解速率常数均比空白基质中添加无色孔雀石绿降解慢。     

免疫分析法检测无色孔雀石绿研究 Ⅰ人工抗原的合成

目的用免疫分析法检测水产品中无色孔雀石绿残留,研究无色孔雀石绿人工抗原的制备及其鉴定。方法用混酸法对无色孔雀石绿进行衍生化,连接上氨基基团,再经重氮化法与载体蛋白相结合,制备人工抗原。结果对无色孔雀石绿中间合成产物的液质联用分析结果表明,氨基产物中,无色孔雀石绿占51.83%,单氨基加成的无色孔雀石绿产物占40.48%,二氨基加成的无色孔雀石绿产物占7.69%。采用紫外法和Bradford法测定,人工抗原中无色孔雀石绿与载体蛋白的结合比为18∶1~23∶1。结论合成的人工抗原属于高质量的人工抗原。     

水产品孔雀石绿和隐性孔雀石绿快速定量检测研究

采用胶体金免疫层析方法建立了水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的定量检测,并对其样品前处理方法进行了研究。结果表明,孔雀石绿的线性范围为0.25μg/L~8μg/L,线性系数0.996 1;优化后孔雀石绿提取液的pH为4.5,对甲苯磺酸浓度为0.06 mol/L,净化剂为2 g中性氧化铝,脱水剂为2 g氯化钙,氧化剂为100μL 0.1%四氯苯醌;孔雀石绿加标回收率为80.1%~89.6%,隐性孔雀石绿加标回收率为66.9%~72.9%,相对标准偏差1.07%~8.14%。     

隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定

研究制备孔雀石绿(MG)代谢物隐性孔雀石绿(LMG)多克隆抗体进而间接鉴定鱼体中孔雀石绿的残留。首先利用化学方法合成含羧基的隐性孔雀石绿衍生物(CLMG),然后采用碳化二亚胺法偶联牛血清白蛋白(BSA)合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA,按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗隐性孔雀石绿多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附实验(iELISA)测定抗血清中抗隐性孔雀石绿多克隆抗体效价。结果表明：抗隐性孔雀石绿的抗体效价为1: 32000,可用于隐性孔雀石绿的免疫学检测。     

基于混合抗体的酶联免疫分析方法同时检测孔雀石绿和隐孔雀石绿

孔雀石绿是"三致"物质,常被非法使用于渔业生产。水产品和环境中常以孔雀石绿和隐孔雀石绿两种形式同时存在,均具有强致癌性。但由于二者结构差异较大,现有的单克隆抗体只能分别检测样品中单一药物的残留量,难以客观地反映出孔雀石绿和隐孔雀石绿的总残留量。目前同时检测两种结构的免疫分析方法鲜有报道,本文分别制备了针对孔雀石绿和隐孔雀石绿的高特异性单克隆抗体,通过研究混合抗体模式建立了可以同时检测两种物质的酶联免疫分析方法,该方法对孔雀石绿和隐孔雀石绿混合物的半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)为3.27 ng/m L,检测线LOD(IC10)为0.24 ng/m L,线性范围为0.62~17.25 ng/m L。本方法的建立对保障水产品安全具有重要意义,也为混合抗体法同时检测两种或多种残留药物提供了方法借鉴。     

羧基隐性孔雀石绿半抗原及全抗原的合成鉴定

以4-羧基苯甲醛,N,N-二甲基苯胺为原料合成羧基化隐性孔雀石绿(COOH-LMG),经薄层色谱、红外光谱、紫外光谱、液质联用仪鉴定该羧基化隐性孔雀石绿为目标产物。羧基隐性孔雀石绿经碳二亚胺法与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)载体蛋白相结合,分别得到免疫原与包被原。通过紫外分光光度计鉴定,人工抗原偶联物的吸收峰较反应前的反应物的吸收峰发生了漂移,证明耦合成功。新西兰大白兔经免疫原5次免疫后,得到针对隐性孔雀石绿的抗体,效价达1∶64000,为LMG的单抗的制备及其免疫学分析方法提供了重要依据。     

液相色谱紫外／荧光检测法测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿

试验旨在建立一种检测水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的液相色谱-紫外/荧光检测方法,并对样品前处理方法进行简化。在乙腈作为溶剂提取步骤中同时加入酸性氧化铝吸附,提取液离心分离后采用串联的丙磺酸阳离子固相萃取柱(PRS)和酸性氧化铝柱净化,0.05 mol/L的乙酸铵/乙腈(20∶80,V/V)为流动相,采用液相色谱-紫外/荧光检测法同时分析孔雀石绿和隐性孔雀石绿的含量,外标法定量。结果表明:孔雀石绿和隐性孔雀石绿在0.05~1.0 mg/L范围内线性良好,相关系数分别为为0.9999和0.9996,最低检出限分别为0.002 mg/L和0.5μg/L。当加标量分别为10、25、50μg时,空白鱼样的加标回收率在72.0%~91.4%之间,RSD均小于7.5%。该方法准确度高,适于水产品中孔雀石绿及其代谢残留产物—隐性孔雀石绿的分析检测。     

水产品中孔雀石绿检测方法的研究进展

孔雀石绿(malachite green, MG)由于其对水产品疾病防治的高效性和低廉的成本而被广泛用作水产养殖业的杀菌剂和杀寄生虫剂, 因此常见于水产品和环境用水中。但是, MG及其主要代谢产物隐性孔雀石绿(leuco-malachite green, LMG)也是有毒的有机污染物, 对人体和其他生物的健康有害。近年来, 已经提出了用于检测MG和LMG的多种方法。用于测定各种基质中MG和LMG的分析方法包括高效液相色谱法(与紫外-可见、荧光、质谱等检测器联用)、光谱法(紫外-可见分光光度法、荧光法、表面增强拉曼光谱法等)、电化学方法、免疫学测定法(酶联免疫法、化学发光免疫法、免疫层析法等)。本文对近10年来孔雀石绿和隐性孔雀石绿的检测方法进行综述, 并讨论了孔雀石绿和隐性孔雀石绿的未来检测发展趋势和所面临的挑战, 为水产中孔雀石绿的检测方法提供一定参考。     

优化高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中 孔雀石绿及隐色孔雀石绿的残留量

目的对GB/T 19857-2005中检测水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿残留量的高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)进行优化。方法经匀质的水产品样品,加20 mL乙腈和5 g酸性氧化铝旋涡振荡,取4 mL提取液,35℃水浴氮吹近干,用7:3(V:V)乙酸铵和乙腈混合溶液1 mL定容,过0.22μm滤膜。样液用HPLC-MS/MS进行检测,以氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿为内标物进行定量。结果本实验的线性范围在0.5~10.0μg/kg,相关系数为0.9994和0.9995,孔雀石绿和隐色孔雀石绿的平均检出限达到0.0241μg/kg和0.0475μg/kg,方法的回收率在91.1%~107.3%之间,相对标准偏差在1.0%~10.4%之间。结论该方法灵敏度高,准确性好,与GB/T 19857-2005相比,简化了前处理步骤,回收率稳定。通过验证,该方法适用于开展水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿残留的检测。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

产锰过氧化物酶细菌的筛选及其对孔雀石绿脱色的研究

从无锡某木材厂的腐木及腐殖土的表层土样中筛选分离得到6株产锰过氧化物酶的细菌,其中产酶最优的一株菌J09经鉴定为草木犀中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti。在优化的条件下,该菌株发酵72 h锰过氧化物酶产量达到最高值,为607.7 U/L。利用粗酶液和发酵培养液对15 mg/L的孔雀石绿进行脱色处理3 h,脱色率分别达到78.5%和89.8%,好氧条件下的脱色率高于厌氧条件的脱色率,孔雀石绿对该菌具有一定的毒性。     

一株血红栓菌的分离鉴定及其产漆酶发酵条件与脱色研究

本研究从杭州西溪湿地采集到一株白腐真菌的子实体,并分离其菌丝,编号为H-1。结合形态学特征、ITS序列分析和进化树分析,菌株H-1与Trametes sanguinea的同源性最高,鉴定为血红栓菌Trametes sanguinea H-1。进一步研究在液态发酵条件下碳源、氮源、诱导剂和摇瓶装液量对T. sanguinea H-1胞外漆酶产量的影响,结果表明,以小麦淀粉为碳源,酒石酸铵为氮源,硫酸铜为诱导剂,250 mL的摇瓶装液量为100 mL,血红栓菌H-1产漆酶的酶活力最高,其酶活力达到3527.8 U/L。native-PAGE分析,其漆酶可能大小约为45 kDa的单一蛋白。血红栓菌H-1漆酶对刚果红脱色率达到65.4%,对孔雀石绿脱色率达到47.5%,对亚甲基蓝的脱色率达到31.3%。本研究可为血红栓菌H-1在染料废水脱色的应用奠定基础。     

高效液相色谱-荧光检测器测定水产品中孔雀石绿残留总量的研究

建立了水产品中孔雀石绿残留总量的液相色谱检测方法。样品中的孔雀石绿全部还原为无色孔雀石绿后,用乙腈-缓冲液提取,经净化、浓缩后,以Symmetry shieldTM RP18为固定相,以乙腈-水为流动相,使用荧光检测器检测无色孔雀石绿。无色孔雀石绿线性范围为1～160ng/ml;方法检出限为1.0μg/kg(以孔雀石绿总量计);回收率为82.6%～92.6%。     

Biotransformation of malachite green by Saccharomyces cerevisiae MTCC 463

In recent years, use of microbial biomass for decolourization of textile industry wastewater is becoming a promising alternative in which some bacteria and fungi are used to replace present treatment processes. Saccharomyces cerevisiae MTCC 463 decolourized the triphenylmethane dyes (malachite green, cotton blue, methyl violet and crystal violet) by biosorption, showing different decolourization patterns. However, malachite green decolourized by biosorption at the initial stage and further biodegradation occurred, about 85% in plain distilled water within 7 h, and about 95.5% in 5% glucose medium within 4 h, under aerobic conditions and at room temperature. Decolourization of malachite green depends on various conditions, such as concentration of dye, concentration of cells, composition of medium and agitation. HPLC, UV-VIS, FTIR and TLC analysis of samples extracted with ethyl acetate from decolourized culture flasks confirmed the biodegradation of malachite green into several metabolites. A study of the enzymes responsible for the biodegradation of malachite green in the control and cells obtained after decolourization showed the activities of laccase, lignin peroxidase, NADH-DCIP reductase, malachite green reductase and aminopyrine N-demethylase in control cells. A significant increase in the activities of NADH-DCIP reductase and MG reductase was observed in the cells obtained after decolourization, indicating a major involvement of reductases in malachite green degradation.     

4种烹饪方式对草鱼肉中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物消减的影响

目的探讨煮、蒸、炸和微波等4种烹饪方式对草鱼肉中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物消减的影响。方法在空白草鱼肉中添加孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫后,分别用4种方式烹饪,采用高效液相色谱串联质谱测定药物的含量。结果结果表明:经过炸、微波、煮和蒸等烹饪方法处理后,鱼肉中的药物浓度分别降低了79.8%～93.7%、69.4%～91.2%、72.0%～86.2%和69.6%～77.8%。相同的烹饪方式,原药的消减速度均高于代谢物,药物的消减速率顺序为:炸微波煮蒸。结论高温加热能促进孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的消减。     

养殖水中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫、亚甲基蓝残留量的测定

目的建立一种高效液相色谱-串联质谱同时测定养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物和亚甲基蓝残留量的方法。方法将水样用盐酸羟胺-对甲苯磺酸溶液和乙腈提取,二氯甲烷萃取2次后浓缩,用1 mL乙腈-5 mmol/L乙酸铵(1:1,V:V)定容。以乙腈-5 mmol/L乙酸铵(85:15,V:V)混合溶液为流动相进行色谱分离,然后进入串联质谱仪,选用电喷雾离子源,在正离子、多反应监测扫描模式下进行定性,孔雀石绿和结晶紫通过内标法定量,亚甲基蓝通过外标法定量。结果在优化条件下,孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫在0.025~0.600 ng/mL浓度范围内,亚甲基蓝在0.05~1 ng/mL浓度范围内均满足线性关系,相关系数r0.99,方法检出限为0.2 ng/mL。加标浓度在0.2~2.0 ng/mL时,孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫和亚甲基蓝的平均回收率均在70%~110%之间,相对标准偏差均在10%以内。结论该方法简单快速、灵敏度高、前处理成本低、重现性好、回收率高,适用于同时检测养殖水体中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝残留量。     

铁基金属–有机框架材料/活性碳纤维复合材料的制备及其对染料的脱色

为提高铁基金属–有机框架材料MOF(Fe)的重复使用性能,以均苯三甲酸、硫酸亚铁、活性碳纤维(ACF)为原料,采用室温原位生长法制备了铁基金属–有机框架材料/活性碳纤维复合材料MOF(Fe)/ACF。借助傅里叶红外光谱仪、扫描电子显微镜、能谱仪、X射线衍射仪对复合材料的结构、形貌、元素组成等进行了表征;测试了复合材料在不同条件下对50 mg/L活性黑KN–B染液的脱色效果,并探讨了光催化降解染料的机制。结果表明:黑暗条件下,分别在不加双氧水和加入0.12 mL/L双氧水时反应60 min后,MOF(Fe)/ACF对活性黑KN–B染液的脱色率分别为64.7％和80.2％;在1 000 W氙灯光照下,加入0.12 mL/L双氧水反应60 min后,MOF(Fe)/ACF 对活性黑KN–B染液的脱色率达95.7％,比ACF高52.2％;重复使用5次,MOF(Fe)/ACF对活性黑KN–B染液的脱色率仍可达86.0％。     

超分子双波长共振光散射法测定半胱氨酸含量

对半胱氨酸-孔雀石绿体系的反应条件进行优化,建立孔雀石绿单波长、双波长共振光散射光谱法检测半胱氨酸的新方法。结果表明：在硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中,孔雀石绿与硼酸结合产生共振光散射,在波长285、338 nm处有2 个较强烈的共振光散射峰;加入半胱氨酸后,共振光散射更加强烈,且共振光散射强度随着半胱氨酸浓度增加而增强。在波长285、338 nm处,半胱氨酸在0.10～0.60 mg/L范围内与体系共振散射强度差值（ΔI）呈线性关系,检出限分别为10.7、13.3 μg/L;双波长叠加法的检出限为3.23 μg/L。本方法可应用于半胱氨酸护肝胶囊和酱油中半胱氨酸的含量测定,测定值的相对标准偏差（n＝6）均在3%以内,符合定量分析的要求。     

孔雀石绿单克隆抗体的制备及鉴定

以合成的孔雀石绿- 牛血清白蛋白(MG-BSA)为免疫原免疫Balb/c 小鼠,利用杂交瘤细胞技术,建立1 株稳定分泌孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞5G6,其分泌的抗体亚类为IgG1,轻链为κ型。间接ELISA 测定腹水效价达1.28 × 105。间接竞争ELISA(ciELISA)显示其对孔雀石绿的50% 抑制浓度(IC50)为1.36ng/ml,除结晶紫(CV)外,与无色孔雀石绿(LMG)没有交叉反应。