单糖高效液相色谱法检测技术研究进展

高效液相色谱法因操作简单、高效和灵敏度高成为单糖分析的重要方法之一。文章介绍几种常用单糖分析的高效液相色谱方法,即液相色谱示差折光检测法、液相色谱蒸发光散射检测法、PMP柱前衍生化检测法、对氨基苯甲酸柱前衍生法、邻氨苯甲酸衍生法、柱后衍生法,指出它们的优缺点,并从灵敏度、操作方法、精确度等方面进行分析比较。     

生物降解九资河茯苓多糖的HPLC图谱分析

通过柱前衍生化高效液相色谱（HPLC）法分析生物降解茯苓多糖的组分。选用黑曲霉HS-5液体发酵,生物降解茯苓多糖。粗多糖液经浓缩、Sevage法纯化、真空干燥处理得到多糖固体样品。利用红外光谱（IR）和紫外光谱（UV）分析鉴定多糖,采用PMP柱前衍生化HPLC法分析,通过与对照品的出峰时间比较,确定其分子中的单糖组成与含量分别为：甘露糖5.463%、鼠李糖8.970%、D-木糖52.809%。     

柱前衍生化高效液相色谱法测定生物样本中短链脂肪酸及乳酸含量

建立一种适用于同时测定肠内容物、血清等生物样品中短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）及乳酸含量的方法。使用气相色谱法、高效液相色谱法、柱前衍生化高效液相色谱法检测小鼠粪便中SCFAs及乳酸含量并进行对比分析；对建立的柱前衍生化高效液相色谱法进行方法学评价，并将其应用于肠内容物、血清等生物样品的分析。结果表明：气相色谱法可快速检测乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，但不能同时检测乳酸；高效液相色谱法杂峰多，检测乙酸含量误差大，准确度不高；柱前衍生化高效液相色谱法检测范围广，可同时检测肠内容物与血清中乳酸及5 种SCFAs的含量，样品色谱图杂峰少，各组分分离度高，方法准确度高，各组分测定的变异系数均不高于8.87%。在同时检测肠内容物与血清等生物样品中SCFAs及乳酸含量方面，相比于气相色谱法和高效液相色谱法，柱前衍生化高效液相色谱法更具技术优势，更能有效满足当前迅猛发展的微生物组学、代谢组学的复杂样品中对SCFAs及乳酸含量准确分析的应用需求。     

猪屎豆种子胶多糖的单糖组分分析

采用气相色谱法、高效液相色谱法和薄层层析法研究猪屎豆种子胶多糖的单糖组分及其含量,实验结果表明,猪屎豆种子胶多糖主要是由半乳糖和甘露糖组成的半乳甘露聚糖,气相色谱法测定其单糖组分百分含量分别为25.377%和60.282%;半乳糖与甘露糖物质的量的比为1:2.375。液相色谱测定其单糖组分百分含量分别为29.261%和70.739%;半乳糖与甘露糖物质的量的比为1:2.417。结论：气相色谱法与HPLC 测定结果非常接近。该方法简便、实用、可靠,适用于半乳甘露聚糖的单糖组分定性和定量的分析。     

柱前衍生法测定桂花多糖中的6种单糖的含量

建立桂花中6种单糖的含量测定方法。采用PMP柱前衍生法和高效液相色谱法(HPLC)分离检测6种单糖含量的方法。色谱条件:色谱柱为Eurosp Her 100-5 C_(18) (200 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为乙腈-磷酸缓冲液(18∶82),柱温40℃,流速1.0 mL/min,检测波长250 nm,进样量20μL。所建立的PMP衍生化-HPLC法可准确地测定桂花中甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、果糖(Fru)、半乳糖(Gal)这6种单糖。结果表明:HPLC柱前衍生法测定单糖含量简便、快捷,并且测定结果相差较小,灵敏度高,测定结果准确,重现性好。     

钝顶螺旋藻多糖的分离纯化及组成分析

目的：对钝顶螺旋藻多糖进行提取、分离纯化和热降解,并对不同多糖组分的基本化学性质和糖链的精细组成进行分析。方法：采用蛋白酶酶解、醇沉、阴离子交换色谱法和热降解,从钝顶螺旋藻中提取和分离纯化出P0、P0.2、P0.4、P0.6、P0.8五种多糖组分及其热降解产物。采用高效凝胶排阻色谱法、离子色谱法、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生-高效液相色谱法和亲水液相色谱-高分辨傅里叶转换质谱（hydrophilic interaction liquid chromatography-Fourier transform mass spectrometry,HILIC-FTMS）联用技术,分析比较不同多糖组分的化学性质和糖链精确组成。结果：钝顶螺旋藻多糖中P0、P0.2、P0.4和P0.6组分硫酸根质量分数在6%～7%,而P0.8组分硫酸根质量分数最高（14.46%）。单糖组成分析结果说明,P0组分是1 种葡聚糖,P0.2组分是主要由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖等中性糖组成的杂多糖;而P0.4、P0.6和P0.8组分主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和半乳糖组成的结构非常复杂的硫酸鼠李聚糖。采用HILIC-FTMS分析多糖组分热降解产物中的寡糖组成,发现P0.2糖链主要是由己糖单糖、戊糖二糖、脱氧己糖-戊糖寡糖、脱氧己糖-糖醛酸的寡糖片段组成,硫酸根在脱氧己糖、戊糖和己糖上,糖链组成复杂。而P0.4和P0.6组成相似,主要鼠李糖-戊糖寡糖、鼠李糖-葡萄糖醛酸寡糖、戊糖二糖和三糖寡糖片段组成,硫酸根连接在鼠李糖和戊糖上。结论：钝顶螺旋藻中有多种不同结构的复杂硫酸多糖,其中葡萄糖醛酸-鼠李聚糖是钝顶螺旋藻中特有的一种硫酸多糖。     

虾夷马粪海胆生殖腺多糖形成多聚体现象研究

在提取海胆生殖腺多糖过程中发现提取产物存在多糖聚合现象。为揭示多糖聚合原因,以Sephadex G-75对多糖进行纯化,将得到的海胆生殖腺多糖SUGP进行高效液相色谱法分析。试验结果表明:SUGP在氯化钠盐溶液存在的情况下在液相色谱图中出现单一峰,为纯度良好多糖;但在去除氯化钠盐离子后,SUGP在液相色谱图中出现两个分子量大小不同的检测峰。分子量检测结果表明SUGP单体的分子量为4 436 Da。PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析SUGP单糖组成表明,SUGP单糖组成为甘露糖、葡萄糖和氨基葡萄糖。     

柱前衍生化法分析木槿花多糖中单糖组成

通过柱前衍生化-HPLC法对木槿花多糖中的单糖组成进行分析,并建立木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸5种单糖的含量测定方法。对液相色谱条件、多糖水解条件、衍生化条件进行考察优化,通过比较单糖衍生物的峰面积,确定木槿花多糖水解产物单糖的含量测定方法。结果表明,液相色谱条件为C18色谱柱、30℃柱温、流动相0.1 moL/L乙酸铵溶液-乙腈(80+20, V/V)。水解条件为1 mol/L盐酸溶液、110℃水解温度、60 min水解时间。衍生化条件为70℃衍生化温度、90 min衍生化时间。该方法操作简单,重复性高,可用于测定木槿花多糖中单糖含量。     

一种姬松茸多糖的纯度鉴定与单糖组成分析

目的:鉴定一种经分离纯化得到的姬松茸多糖的纯度,并分析其单糖组成。方法:采用苯酚-硫酸法测定姬松茸多糖总糖含量,结合凝胶过滤法、高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法和紫外可见吸收光谱法鉴定其纯度,运用高效液相色谱-柱前衍生化法对其单糖组成进行定性、定量分析。结果:所得姬松茸多糖样品的多糖含量为99.50%±2.5%(W/W,以葡萄糖计),且不含核酸、蛋白质等杂质,纯度较高,其单糖组成为葡萄糖、半乳糖、甘露糖(含量比分别为99.2%、0.6%、0.2%)。结论:所得姬松茸多糖是一种纯度较高、葡萄糖为主要单糖的均一多糖。     

高效液相色谱法测定松藻多糖中醛糖的绝对构型

本论文通过高效液相色谱(HPLC)法对3个松藻多糖组分进行单糖组成及单糖绝对构型的测定,该方法简单快速,所需的高效液相色谱仪及C18色谱柱在实验室普遍应用,为天然多糖中单糖绝对构型的测定提供参考。     

大粒车前子多糖酸水解产物的分析

经水提、醇沉、Sevag除蛋白后得到精制大粒车前子多糖（Plantago asiatica L. polysaccharide,PLP）,采用0.3 mol/L三氟乙酸对PLP进行部分酸水解。建立超高效液相色谱-蒸发光散射检测器技术筛选较优水解条件的方法,同时运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用法分析产物。结果表明：车前子多糖除蛋白后多糖含量为68.56%。在水解温度90 ℃、水解时间1.5 h条件下,能够得到比较多的水解产物,经超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用分析鉴定,水解产物中含有单糖、二糖至低聚六糖,并且存在戊糖和己糖相互连接的片段,但并未发现多个己糖相互连接的片段。     

莲子红衣多糖的分离纯化及结构表征

以莲子红衣为实验对象,将其中的多糖进行分离、纯化并表征结构。采用酶提醇析法提取莲子红衣粗多糖,选择DEAE-C阴离子交换树脂和Sephadex G-25凝胶柱层析,从莲子红衣粗多糖中分离纯化得到中性多糖和酸性多糖两种组分。经凝胶渗透色谱测定,中性和酸性多糖的重均分子质量分别为3.78×104 D和4.94×104 D,纯度分别为91.16%和90.24%。中性多糖组分由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖4 种单糖组成;酸性多糖组分由葡萄糖、木糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖5 种单糖组成。红外光谱证明两种多糖中均含有糖类特征吸收峰,且为α构型的吡喃型多糖。核磁共振氢谱检测又进一步证实了两种多糖均为α构型。     

高效液相色谱法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量

建立一种简单快速的邻苯二甲醛柱前衍生,紫外检测反相高效液相色谱测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的方法。色谱柱为Intertsil ODS-C18柱,梯度洗脱,紫外吸收波长为332 nm,线性方程为Y=9.26×106X+2 093.79,r=0.999 5,方法线性范围为0.005~0.06 mg/mL,检出限为2.927 ng,峰面积的相对标准偏差为0.57%,回收率范围为98.85%~100.94%。该方法易于操作、反应时间短、精密度高。用该方法测定了20种发芽糙米中γ-氨基丁酸含量(22.68~88.36 mg/100 g,以干质量计),结果表明,发芽糙米中γ-氨基丁酸含量随品种不同而不同,其中中嘉早17和浙福802明显高于其他品种(P0.05),故在实际生产中可尝试作为发芽糙米副产品的原料。     

茄枝多糖的分离纯化及成分分析

研究茄枝多糖的提取工艺和主要单糖组分。通过水提工艺,比较三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）、Sevag、TCA与木瓜蛋白酶结合、Sevag与木瓜蛋白酶结合4 种脱除蛋白方法,使用DEAE-D22纤维素柱与SephadexG-100柱层析精制获得茄枝多糖ESP1-1,并对其进行薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）检测与组分分析。木瓜蛋白酶与TCA法结合脱除蛋白效果最佳,蛋白清除率达到93%,多糖损失率为45.3%;TLC、HPLC检测与分析证明ESP1-1具有多糖的理化性质,主要由甘露糖、葡萄糖、果糖、木糖4 种单糖组成。研究结果可为茄枝多糖的开发应用提供理论支持。     

黄酒中9 种生物胺的高效液相色谱分析法

建立一种检测黄酒中生物胺的反相高效液相色谱法。用三氯乙酸提取黄酒中生物胺,丹磺酰氯作为衍生化试剂,1,7-二氨基庚烷作为内标定量。色谱条件为：Waters XBridge C18色谱柱（4.5 mm×250 mm,3.8 μm）作为分离柱,乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱,流速1 mL/min,紫外检测波长254 nm。结果表明,9 种生物胺（盐酸吡哆胺、色胺、腐胺、尸胺、β-苯乙胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺）在40 min内能被很好分离。在1～50 mg/L质量浓度范围内,各种生物胺呈现良好的线性相关性（R2＞0.999）。各生物胺加标回收率为79.54%～89.55%,相对标准偏差为3.14%～6.35%,该法各组分检出限（RSN=3）为0.002～0.009 mg/L。应用柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测法,实现了黄酒中生物胺的准确检测。     

枯草芽孢杆菌木聚糖酶的克隆表达及其酶解两种木聚糖的产物分析

通过基因克隆方法获得枯草芽孢杆菌木聚糖酶XynA,考察经镍离子亲和柱纯化后的XynA分别在桦木木聚糖和毛榉木木聚糖中的酶解情况,利用薄层色谱法（thin layer chromatography,TLC）及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/MS）法鉴定木聚糖酶XynA的酶解产物。运用MALDI-TOF/MS分析枯草芽孢杆菌木聚糖酶XynA酶解桦木木聚糖和毛榉木木聚糖产物不同的聚合度寡糖的分布情况。结果表明：在桦木木聚糖酶解液中,产生的中性木寡糖主要为木二糖（X2）和木三糖（X3）,酸性木寡糖聚合度为4～12,并且每一个酸性木寡糖上仅连接着一个甲基葡萄糖醛酸侧链（MeG）。在毛榉木木聚糖酶解液中,产生的中性木寡糖与在桦木木聚糖酶解液中相同,酸性木寡糖的结构相似,聚合度为4～16。因此木聚糖酶XynA具有生产木二糖（X2）和木三糖（X3）以及酸性木寡糖（MeGXn）的功能。     

高效液相色谱法检测鲫鱼不同组织中的胶原蛋白含量

为提高水产品胶原蛋白的利用率,采用柱前衍生-高效液相色谱法对鲫鱼鱼皮、鱼肉、鱼鳞、鱼鳔组织中的羟脯氨酸含量进行检测,再将羟脯氨酸含量换算成相应胶原蛋白的含量。鲫鱼样品经盐酸110 ℃水解18 h,丹磺酰氯衍生,采用高效液相色谱-紫外法进行检测。色谱柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）;流动相：A为甲醇,B为四氢呋喃-甲醇-0.05 mol/L乙酸钠（1∶15∶84,V/V）溶液,采用梯度洗脱;流速1 mL/min;柱温40 ℃;检测波长254 nm。结果表明：羟脯氨酸在20～400 μg/mL范围内呈现良好的关系（R2=0.999 8）,最低检测限为0.18 μg/g,不同水平的平均回收率为80.22%～83.33%,相对标准偏差范围为0.31%～1.84%。实际样品分析显示,鱼皮、鱼肉、鱼鳞、鱼鳔组织中胶原蛋白含量分别为106.62、24.75、166.94、115.05 mg/g。本实验建立的分析方法简便快捷、具有较好的灵敏度和可靠性,可用于水产品不同组织中胶原蛋白的定量分析。     

体外模拟3 种消化液对铁皮石斛多糖的消化作用

本实验采用人体胃肠道模拟系统,体外模拟3 种消化液对铁皮石斛多糖的消化行为。通过高效凝胶液相色谱、铁氰化钾法和高效离子交换色谱分别测定消化后多糖分子质量变化、还原糖含量和单糖组成的情况。结果表明：唾液不能改变铁皮石斛多糖的分子质量;模拟胃液和模拟胃肠液可以降低多糖的分子质量,同时提高多糖溶液中的还原糖含量,但没有检测到单糖。结论：在体外模拟胃肠道的消化体系中,铁皮石斛多糖的分子质量减小,糖苷键发生断裂,但没有游离单糖的释放。     

蔗渣制备低聚木糖溶液的脱色脱盐工艺及其组分分析

利用活性炭结合阴阳离子交换树脂吸附技术研究甘蔗渣制备低聚木糖溶液的脱色脱盐工艺,并采用高效液相色谱分析精制后的低聚木糖溶液组分。结果表明：活性炭对低聚木糖溶液最佳脱色工艺为活性炭添加量质量分数1%、反应温度60 ℃、吸附时间1 h,在该条件下溶液脱色率为80.25%、还原糖保留率为98.70%。通过对7 种不同型号的树脂进行筛选,确定选用001×7和D301树脂串联、V（001×7）∶V（D301）=2∶1、流速254 mL/h时,离子交换树脂对低聚木糖脱盐效果最佳。经过活性炭和离子交换树脂共同脱色脱盐,低聚木糖溶液的最终脱色率为92.4%、脱盐率为79.2%,溶液接近中性（pH 7.4）。高效液相色谱法分析确定低聚木糖水解得到的单糖主要为木糖,还含有少量的甘露糖和葡萄糖,其中木糖占所有单糖的88.9%;低聚木糖溶液主要为木二糖和木三糖,还含有少量的木糖和木五糖。     

响应面试验优化固体酸催化剂催化玉米皮半纤维素水解工艺

采用SO₄^2－/Fe₂O₃/γ-Al₂O₃负载型固体酸催化剂,催化玉米皮半纤维素水解,对反应工艺条件进行研究。选择催化剂用量、水解温度、水解时间、料液比进行单因素试验,在此基础上采用Box-Behnken试验设计,以戊糖收率为响应值进行响应面分析试验,确定最优工艺参数。结果表明：各因素对戊糖收率的影响主次顺序为：催化剂用量＞水解温度＞水解时间＞料液比;通过响应面法优化并修正得最佳工艺条件为催化剂用量12 mL/10 g玉米皮、水解温度120 ℃、水解时间4 h、料液比1∶10,在此条件下戊糖最高收率为22.45%,与理论预测值基本一致。高效液相色谱分析结果表明,玉米皮水解液主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖3 种单糖组成,比例为葡萄糖4.99%、木糖34.78%、阿拉伯糖55.90%;玉米皮及其水解后残渣红外光谱分析表明,半纤维素中木糖基和阿拉伯糖基结构均发生了变化,说明半纤维素发生了降解。