黄酒多肽的多级分离纯化及其对小鼠巨噬细胞免疫调节的影响

本研究以黄酒为原料,通过大孔树脂吸附、凝胶色谱等方法多级分离纯化黄酒中活性肽组分,并探究各级分离肽组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用的影响。通过脂多糖LPS(1 μg/mL)刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型,以不同浓度的各级分离纯化的黄酒多肽样品进行干预,对NO释放抑制率最高的黄酒多肽组分进行结构分析。结果表明,可通过大孔树脂初步分离纯化黄酒活性多肽。对3种不同型号大孔树脂的吸附解析性能进行比较,最终选择DA201-C大孔吸附树脂富集黄酒多肽,收集洗脱液旋蒸冻干后获得黄酒多肽SJ组分。采用MTT法检测细胞活力,黄酒多肽SJ作用RAW264.7细胞的安全范围为≤2.5 mg/mL。采用Griess Reagent法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)含量,与LPS模型组相比,黄酒多肽SJ浓度为0.3、0.6、1.2、2.5 mg/mL时能明显抑制NO释放(抑制率分别为20.85%、36.42%、68.58%、95.01%)。黄酒多肽SJ经Sephadex G-15凝胶色谱柱分离得到3个组分即G₁、G₂、G₃,分别收集这三组洗脱峰并测定其对RAW264.7细胞NO分泌量的影响。研究发现G₁组分活性高于其他2种组分,G₁、G₂、G₃的NO释放半抑制浓度分别是0.68、0.86、0.75 mg/mL。对G₁组分进行氨基酸组成分析得知其疏水氨基酸占比32.63%,必需氨基酸占比28.46%。研究结果证明黄酒多肽能显著抑制LPS诱导的RAW264.7分泌NO,对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症具有保护作用,从而促使巨噬细胞发挥免疫作用。     

硒化低聚氨基多糖对RAW264.7细胞的免疫调节作用

本实验旨在研究硒化低聚氨基多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能的影响。用噻唑蓝比色法分别考 察硒化低聚氨基多糖、Na2SeO3对巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响,并观察巨噬细胞形态的变化。通过中性红 法、酶联免疫吸附测定法及实时荧光定量反转录聚合酶链式反应法分别检测巨噬细胞的吞噬能力、肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素（interleukin,IL）-6及IL-10细胞因子的分泌量及其mRNA表达水平。 结果表明：硒质量浓度为100～1 000 μg/L时,硒化低聚氨基多糖对细胞的相对增殖率无显著影响;而Na2SeO3的硒 质量浓度超过200 μg/L即对巨噬细胞RAW264.7产生细胞毒性作用。硒化低聚氨基多糖能增强巨噬细胞吞噬活性, 显著提高RAW264.7细胞TNF-α、IL-6及IL-10分泌量及其mRNA表达水平,且效果比Na2SeO3处理组、低聚氨基多糖 处理组及Na2SeO3＋低聚氨基多糖复合添加组好。实验结果提示硒化低聚氨基多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有一 定的免疫调节作用。     

醋蛋液对巨噬细胞RAW264.7免疫调节活性的影响

采用细胞计数试剂盒（CCK）-8法检测不同剂量的醋蛋液对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节活性的影响,倒置显微镜及荧光显微镜下分别观察不同分组条件下对RAW264.7细胞形态的影响及细胞核的损伤程度,探讨醋蛋液对RAW264.7细胞分泌免疫因子的影响及其免疫调节活性的机理。结果表明,当醋蛋液浓度为40 μL/mL时,RAW264.7细胞活性极显著升高为（145.3±23.02）%（P＜0.01）。醋蛋液高剂量组（20 μL/mL）巨噬细胞体积变大并逐渐伸出伪足,与正常细胞有明显差异,但未达到炎症相关形态学特征;醋蛋液高剂量组（20 μL/mL）可以促进巨噬细胞分泌白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO）分泌,可以有效缓解巨噬细胞细胞核损伤、细胞膜电位降低造成的细胞损伤及细胞凋亡;醋蛋液高剂量组（20 μL/mL）可以上调蛋白激酶B（AKT）以及核因子-κB（NF-κB）的表达量,进而激活巨噬细胞,调节机体免疫力。     

鹿胎肽对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

本实验从鹿胎中提取鹿胎肽（DFP）,通过体外实验研究其对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用。采用噻唑蓝（MTT）实验检测超滤组分各肽段的增殖活性,筛选增殖活性高的组分。选用中性红吞噬实验、酶联免疫吸附检测法测定DFP对RAW264.7细胞吞噬指数、一氧化氮（NO）浓度及细胞因子如白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌能力,同时还研究了DFP对巨噬细胞各周期分布的影响。结果表明,分子质量小于1 kDa的DFP-5对巨噬细胞RAW264.7作用后,可显著（P<0.05）提高巨噬细胞的增殖活性、吞噬活性、NO释放量以及细胞因子的分泌水平,并且在DFP-5质量浓度为25 μg/mL时效果最好。细胞周期结果表明,DFP-5能够促进RAW264.7细胞的生长,且主要作用在G0/G1期。以上结果表明,鹿胎肽具有增强免疫能力的潜在作用。     

大米肽中压离子交换色谱分离及其免疫活性评价

为进一步提高经过DA201-C型大孔吸附树脂脱盐、40%乙醇梯度洗脱的大米免疫活性肽RPHs-A3组分的纯度和免疫活性,采用中压离子交换色谱对其进行进一步分离纯化,并对分离得到组分的免疫活性进行了评价。结果表明,采用WorkBeads 40Q强阴离子交换树脂、2.6cm×40cm色谱柱对RPHs-A3组分进行分离的最佳条件为:上样浓度30mg/mL,上样量5 mL,起始缓冲液A为pH 9.0的0.01mol/L Tris-HCl,洗脱缓冲液B为含1 mol/L NaCl的pH 9.0、0.01 mol/L Tris-HCl,上样、洗脱流速分别为1,10mL/min。共收集到5个组分,其中RPHs-A3-B3组分在MTT试验和小鼠巨噬细胞脂多糖(LPS)炎症模型中皆表现出较高免疫活性,对RAW264.7细胞具有显著增殖作用,其SI值为1.315;且对炎症模型中细胞内NO释放量具有显著抑制作用(P0.05),抑制率为8.28%。采用中压离子交换色谱能有效地对RPHs-A3组分进行分离纯化,使SI值从1.273提高到1.315,且对细胞内NO释放量具有显著抑制作用。     

壬基酚异构体NP42对小鼠RAW264.7巨噬细胞的损伤作用

目的:研究壬基酚异构体NP42对小鼠巨噬细胞RAW264.7的损伤作用并探究其分子机制。方法:以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,将不同浓度NP42(0.1~100 μmol/L)作用于细胞24 h,采用噻唑蓝法检测细胞存活率,酶联免疫分析检测环磷酸鸟苷(cGMP)和环磷酸腺苷(cAMP)含量,RT-PCR法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表达水平,Western blot法检测蛋白激酶C(PKC)的表达情况以及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的磷酸化水平。结果:0.1~10 μmol/L NP42对细胞存活率无显著影响,100 μmol/L NP42能显著降低RAW264.7细胞的存活率(P < 0.01)。与对照组相比,NP42处理24 h能显著抑制细胞TNF-α mRNA和iNOS mRNA的表达,抑制细胞PKC蛋白的表达和降低细胞内cAMP的含量,同时增强细胞内cGMP的含量。NP42处理能显著下调p38的磷酸化水平。结论:壬基酚异构体NP42通过PKC-cAMP信号通路以及p38-MAPK信号通路对小鼠巨噬细胞RAW264.7产生损伤作用,这可能是壬基酚发挥免疫损伤的主要分子机制。     

血红素氧合酶-1介导海参蛋白肽对脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用

为研究海参蛋白肽对脂多糖(LPS)诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用及作用机制,本研究利用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型,采用Griess法测定细胞一氧化氮(NO)含量,实时荧光定量PCR测定细胞内诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)以及血红素氧合酶-1(HO-1)m RNA表达。结果表明,海参蛋白肽以浓度依赖效应显著抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NO生成以及TNF-α、IL-1β、IL-6和i NOS m RNA表达(p0.05),显著提高细胞内HO-1 m RNA表达(p0.05)。HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ(Zn PP-Ⅸ)部分逆转海参蛋白肽对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用。具有抗炎活性的海参蛋白肽富含甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸,分子量180~1000 u的组分为72.12%。这些结果说明海参蛋白肽通过上调细胞HO-1 m RNA表达发挥抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的作用。     

大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物对RAW264.7细胞的免疫调节作用

目的：研究大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物对小鼠巨噬细胞系RAW264.7的免疫调节作用。方法：将小鼠RAW264.7细胞分为空白组、脂多糖组和样品组（大豆分离蛋白、杏鲍菇多糖、大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖混合物及共价结合物）,分别测定并比较各组细胞的巨噬细胞活力、中性红吞噬活性、一氧化氮释放量、细胞因子分泌及其mRNA表达水平。结果：当质量浓度在0～50?μg/mL范围时,大豆分离蛋白、杏鲍菇多糖、大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖混合物和大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物组4?种样品对细胞活力没有显著影响（P＞0.05）。当大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物的质量浓度达到100?μg/mL时,能够显著提高细胞的中性红吞噬活性、一氧化氮释放量以及肿瘤坏死因子-α、白细胞介素1β（interleukin 1β,IL-1β）和IL-6的含量及这3 种细胞因子的mRNA表达水平（P＜0.05）,表明大豆分离蛋白-杏鲍菇多糖共价结合物能显著提升小鼠巨噬细胞系RAW264.7的免疫调节能力,且存在剂量依赖效应。结论：本研究可对大豆分离蛋白进行糖基化改性,为谷物蛋白的深加工和开发利用提供一定的理论依据。     

酱油渣中免疫活性肽水解用酶的筛选

为筛选制备酱油渣免疫活性肽的最适水解酶,采用小鼠巨噬细胞(RAW264.7)增殖和脂多糖（LPS）炎症模型细胞内NO释放量实验,考察了Acalase、Papain、Pepsin、Trypsin与Protamex水解酱油渣蛋白所得到酶解物的免疫活性。结果表明,制备酱油渣免疫活性肽的最佳水解酶为Acalase,Acalase酶解物对小鼠巨噬细胞的增殖指数(SI)为1.09(6.25 μg/mL),且对脂多糖炎症模型中细胞内NO释放量具有极显著抑制作用,抑制率为10.80%（P<0.01）;其酶解物中180～1 000 u的组分占比81.33%,多肽含量及可溶性氮回收率分别为51.47%和89.43%。     

κ~-卡拉胶十一糖对小鼠巨噬细胞增殖的影响

目的:探讨κ~-卡拉胶十一糖对小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞增殖活性的影响。方法:使用不同浓度的κ~-卡拉胶十一糖作用RAW264.7一段时间后,采用MTT比色法及检测LDH总量,测定细胞增殖率;通过测定LDH释放量及ATP水平,研究κ~-卡拉胶十一糖对细胞膜完整性及细胞活性的影响;绘制细胞生长曲线,观察κ~-卡拉胶十一糖对RAW264.7增殖能力的影响。结果:实验结果显示,使用100μg/m L的卡拉胶十一糖作用RAW264.7细胞24h后,细胞增殖率达到141.5%,且在此条件下,细胞膜完整性、细胞活性及细胞增殖能力的提高最为显著。但当作用时间延长为60h时,κ~-卡拉胶十一糖对细胞数量、细胞膜完整性、细胞活性及细胞增殖能力有影响。结论:在体外条件下,κ~-卡拉胶十一糖对小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7的生长具有促进作用。     

蛹虫草多糖调节小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的分子机制

多种真菌多糖近年来因其免疫调节活性成为保健食品领域研究的热点。本实验以食药用真菌蛹虫草提取物蛹虫草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides,CMP）为研究材料,初步探究CMP对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的调节机制。噻唑蓝实验结果显示CMP无细胞毒性,且100、200 μg/mL CMP可以明显增强RAW264.7细胞活性;中性红法、Griess法和酶联免疫吸附检测结果表明25～200 μg/mL的CMP以剂量依赖方式增强RAW264.7细胞吞噬活性并增加一氧化氮（nitric oxide,NO）和白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）分泌,肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌呈先升高后降低的趋势,在100 μg/mL时达到最高值;抑制剂中和实验结果显示当Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）和甘露糖受体（mannose receptor,MR）受到抑制时,CMP诱导的RAW264.7免疫反应显著降低,这表明TLR4和MR均为CMP激活巨噬细胞的受体;此外,Western blot结果显示丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）信号通路也参与CMP诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。表明TLR4和MR/MAPK信号传导途径在CMP诱导巨噬细胞RAW264.7产生免疫应答时发挥了重要作用。     

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷保护RAW264.7细胞免受过氧化氢诱导的氧化损伤

本研究旨在探究矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside,C3G）对H2O2诱导RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用及其机制。通过噻唑蓝法测定C3G和过氧化氢分别对RAW264.7细胞存活率的影响;采用酶联免疫吸附测定法检测细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活力以及一氧化氮（nitric oxide,NO）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平;利用2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯活性氧荧光探针检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;通过逆转录定量聚合酶链式反应和Western blot法分别测定相关mRNA和蛋白表达水平。结果表明,C3G（6.25～25.00 μmol/L）能显著抑制H2O2诱导RAW264.7细胞活性降低（P＜0.05）。C3G显著降低H2O2诱导RAW264.7细胞内ROS过表达、MDA水平和NO释放（P＜0.05）,显著增加SOD和GSH-Px活力（P＜0.05）。此外,与空白对照相比,400 μmol/L H2O2处理组中,蛋白激酶Mst1/2和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白Keap1的mRNA及蛋白相对表达水平显著上调（P＜0.05）,而细胞中核因子E2相关因子和下游抗氧化酶HO-1的mRNA及蛋白相对表达水平显著下调（P＜0.05）;而采用C3G干预RAW264.7细胞,上述相关mRNA及蛋白的相对表达水平被逆转。结论：C3G对H2O2诱导RAW264.7细胞氧化损伤保护作用,可能与激活Mst/Nrf2信号通路和提高抗氧化酶活性有关。     

体外评估乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用的影响

该研究以商业菌株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG为阳性对照菌,体外评估实验室保藏的5株乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7细胞活性、吞噬活性及免疫活性分子NO、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与白细胞介素-10（IL-10）分泌水平的影响,以期从中筛选出具良好免疫调节作用的菌株。结果表明,鼠李糖乳杆菌260具有更优的免疫调节作用,在特定乳杆菌活菌浓度时,能显著提高巨噬细胞RAW264.7的细胞活性、吞噬活性及NO、TNF-α和IL-10的分泌水平（P＜0.05）。最高细胞增殖率为196.62%;最低乳酸脱氢酶（LDH）释放量为554.36 U/100 mL;最高吞噬活性为136.86%;最高NO分泌量为5.70 μmol/L;最高IL-10分泌量为15.56 pg/mL,最高TNF-α分泌量为50.98 pg/mL。     

鸭蛋卵清蛋白的结构、 组成分析及其功能活性研究

本研究比较了鸭蛋卵清蛋白的三种提取方法,首先采用傅里叶红外线光谱分析仪、圆二色谱和电镜分析卵清蛋白二级结构,再采用半自动氨基酸分析仪进行了营养评价,最后采用RAW 264.7细胞模型和DPPH·、ABTS+·及ORAC抗氧化模型分别探究了其免疫调节活性和抗氧化活性。实验结果表明采用pH4.50、60%饱和硫酸铵沉淀获得的蛋白总氮含量为86.75%±4.12%,蛋白得率为86.17%±2.69%。结构分析表明其中α-螺旋占15.06%,β-折叠占24.69%,β-转角占25.63%,无规则卷曲占33.83%,具有一般清蛋白的表面结构。功能活性模型表明卵清蛋白能显著提高RAW 264.7细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6分泌量(P<0.05),具有免疫调节活性,体外抗氧化活性表明2000 μg/mL卵清蛋白,其ABTS+·清除率为57.05%、DPPH·清除率为26.12%、ORAC值为0.3148 μmol/L TE/mg,显示出有一定的抗氧化活性,为鸭蛋卵清蛋白的基础研究提供理论支撑。     

二十二碳六烯酸免疫调节活性

以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象,采用噻唑蓝法、细胞染色法、相关酶活力的测定以及蛋白 免疫印迹等方法,研究二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）的免疫调节活性。噻唑蓝实验结果表明, 当DHA质量浓度为800 ng/mL,作用48 h时,RAW264.7细胞增殖率达到最大值,为73.03%。中性红实验结果表 明DHA可以显著增强RAW264.7细胞的吞噬活性。扫描电子显微镜结果显示DHA具有促进RAW264.7细胞活化的 作用;吖啶橙染色结果表明在DHA作用下,细胞核酸代谢旺盛,RAW264.7细胞被激活;糖原染色结果表明DHA 能通过促进RAW264.7细胞内糖原代谢加快细胞的分化。通过对RAW264.7细胞中相关酶活力的测定,结果表明 DHA能够显著提高酸性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的活力。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs） 蛋白通路结果表明：DHA能够引起细胞外信号调节激酶1/2、p38和应激活化蛋白激酶出现一定 程度的磷酸化,说明DHA诱导巨噬细胞激活部分依赖了MAPKs信号转导通路。以上研究结果证明：DHA具有一定 的免疫调节活性,可为DHA的应用提供理论依据。     

野生亚侧耳多糖的提取和对巨噬细胞Raw264.7的免疫调节作用研究

本研究从亚侧耳子实体中分离出水溶性亚侧耳多糖(HSP),通过体外实验评估其对Raw264.7巨噬细胞的免疫调节作用。采用WST-1法检测HSP对巨噬细胞增殖作用的影响,Griess试剂检测一氧化氮(NO)浓度,ELISA法检测HSP对淋巴细胞中一肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE₂)等细胞因子分泌量的影响,反转录聚合酶链式反应分析诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α和IL-1β的转录水平表达量。结果表明,HSP可显著提高Raw264.7细胞内NO的浓度,在HSP浓度为100.00 μg/mL时,NO的分泌量达到最大值(29.94 mmol/L)。与空白组相比,HSP可以显著提高TNF-α、IL-1β、PGE₂等免疫因子(P<0.05)的分泌量,其中IL-1β、PGE₂的25 μg/mL剂量组中各因子分泌量(31.9524 pg/mL,1.8174 ng/mL)均与LPS(脂多糖)阳性对照组相接近。反转录聚合酶链式反应分析结果表明,HSP能够提高iNOS和COX-2的蛋白表达量。HSP具有免疫调节的功能,可以作为免疫调节剂添加到功能性食品和药品中。