溶栓纳豆菌的筛选与应用

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,从酱豆、豆豉及纳豆中分离和筛选到５株明显纤溶活性的芽孢菌株,其中ＮＫ－５菌株活性最高,故被用作纤溶活性纳豆生产菌。经鉴定ＮＫ－５菌株为枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ）,该菌株的重要特点是产生强力纤溶酶和大量胞外粘质。后者经鉴定为ｒ－多聚谷氨酸。用ＮＫ－５菌株试制的纳豆既有日本纳豆典型的感官特征和营养组成,还具有很高的纤溶活性,其酶活性在贮存中     

高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,对能产生纳豆激酶的菌株进行了分离筛选,得到了具有较高纤溶活性的四株,考虑到发酵后的纳豆感官,我们最终选择编号为4411、465的菌株作为生产用菌种.根据其形态、生理生化特征以及与枯草芽孢杆菌的比较,初步判断这两株菌株为枯草茅孢杆菌（Bacillus subtilis）.     

纳豆激酶高活性菌株的筛选及其发酵条件的优化

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,从24种豆制品中分离和筛选出3株有明显纤溶活性的芽孢杆菌菌株,其中BN-6菌株活性最高,达到900U/ml。通过单因素试验和正交实验确定了液体发酵纳豆激酶最佳条件培养液中豆粕粉2%,玉米粉1%,初始pH=6.5,温度37℃。     

溶栓纳豆芽孢杆菌的筛选鉴定及产纳豆激酶条件的研究

利用目标纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)所应具有的耐热性、耐盐性、显著的蛋白酶活性及生物素缺陷等生物学特性,设计了定向选育方案,从日本传统食品纳豆中筛选出具有较高纤溶活性的8株枯草芽孢杆菌,命名为 NK-1～NK-8；根据菌落形态、生理生化特征,鉴定为纳豆芽孢杆菌。NK-4菌株经过发酵培养,液体培养指数生长期为4～12h,最佳产酶条件是 pH7．0,培养温度34℃,装液量100mL/500mL。     

豆豉中纳豆芽孢杆菌的筛选及其发酵工艺的研究

利用纤维蛋白平板法,从我国传统食品豆豉中筛选出1株具有高纤溶活性的纳豆芽孢杆菌菌株NK-1.通过单因素试验和正交试验确定了该菌株液体发酵最佳条件:大豆蛋白胨1.0.%,萄糖2.0%,培养温度35℃,初始pH值为7.0,培养时间72h时,该菌产酶纤溶活力可达1225.5尿激酶IU/mL.     

产纤溶酶菌株的分离和鉴定及纤溶酶基因在酿酒酵母中的表达

目的:从豆豉中分离具有强纤溶活性的菌株,实现纤溶酶基因在酿酒酵母中的表达.方法:通过纤维蛋白平板法从豆豉中分离具有强纤溶活性的菌株,结合形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定该菌株;通过PCR扩增豆豉纤溶酶基因,构建pYES2-DFE重组质粒,转化酿酒酵母H158感受态细胞,经β-半乳糖诱导表达后,用纤雏蛋白平板法分别检测发酵液上清和菌体破碎上清的纤溶酶活性.结果:鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);活性检测结果是酿酒酵母发酵液上清具有纤溶酶活性,而菌体破碎上清没有活性.结论:豆豉纤溶酶基因在酿酒酵母中实现了分泌表达.     

纤溶酶高产菌株的筛选与鉴定

作为一种新型的溶血栓药物,大豆类发酵食品中所含有的纤溶酶具有安全性好、作用迅速,成本低,以及可通过液体发酵大规模生产等优点。采用酪蛋白平板法与纤维蛋白平板法相结合的方法,从市售纳豆产品中分离筛选出一株高产纤溶酶生产菌,发酵48 h后,测得其粗酶活为483.72 IU/mL,通过形态学,生理生化特征,16S rDNA序列鉴定及系统发育树的分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。     

纳豆菌的定向筛选及其生物学特征分析

目的从日本成品纳豆中筛选蛋白酶活性高、溶血栓活性显著的纳豆菌,并对筛选获得的菌株进行生物学特征分析。方法用梯度稀释法分离单菌落,然后根据所筛选菌株具有革兰氏染色阳性、淀粉酶活性、高蛋白酶活性、高纤溶酶活性等特征设计纳豆菌株的定向筛选方案。结果获得2株高蛋白酶活性、高纤溶酶活性的纳豆菌BN9和BN23;BN9液体培养物在接种后12 h进入对数生长期,24 h时菌体浓度和蛋白酶活性均达到最高,且生长延滞期的菌体呈长链状结构,对数生长期后期的菌体开始断裂为短杆状。结论采用定向筛选方案获得高溶血栓活性纳豆菌株的方法可行。     

传统调味品中纳豆激酶产生菌的筛选和鉴定

为开发符合中国人口味的纳豆,以传统调味品豆豉和豆酱为样品来源,筛选酶活高和发酵性状优良的纳豆激酶产生菌。分别利用牛奶平板和琼脂糖-纤维蛋白平板进行初筛和复筛;对筛出的菌进行纳豆激酶活性分析、纳豆制作及感官评价等。对性状优良的菌株进行形态观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析等项目的测定;并对其培养基初始pH、发酵温度、盐离子构成等条件对酶活的影响进行单因素分析。结果共分离到15株具有纤溶活性的纳豆激酶产生菌,经计算,从中选出了4株高活力纳豆激酶产生菌(N-1,N-2,N-3,N-4菌株)。N-2菌株纤溶活性最高,其纳豆发酵性状最佳,纳豆拉丝长达80cm,其酶活达到1159U/mL,鉴定结果是该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌最适的单因素液体发酵条件为:培养基初始pH 6.0,添加0.02%浓度的Ca2+盐,发酵温度35℃。在该条件下进行液体发酵,其酶活为1365U/mL,酶活比之前提高了18%。N-2菌株发酵性状优良,可用于纳豆制作。     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取液、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶活性进行研究。结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6~10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

抑菌型纳豆菌株的分离筛选及其微生态菌剂的制备

纳豆杆菌具有抗菌、溶血栓、产生各种胞外酶等优良特征,着重关注了其抗菌活性,期望能够为饲料添加抗菌型微生态制剂的研究提供理论依据。实验从市售不同品种豆豉和纳豆中,分离纯化纳豆菌株23株,并通过对纳豆菌个体特征显微观察、水解酪蛋白实验、VP实验、吲哚实验等生理生化实验进行鉴定。研究了不同纳豆菌株对4种致病菌,志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的抗性特征,选育出7株抗致病菌性能良好的纳豆菌。选育的菌株进行组合发酵,采用冷冻干燥技术制备复合纳豆菌微生态制剂。实验结果显示,选育的纳豆菌株抑菌效果明显,冷冻干燥的微生态制剂中活菌数为1.05×109cfu/g,益生菌的存活率为72.7%。     

具纤溶活性菌株ND2的筛选及其纳豆激酶基因的克隆、表达

从市售的纳豆制品中分离并纯化出一株具有高效纤溶活性的菌株ND2,经生理生化特性及16SrRNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌。通过正交试验优化菌株ND2的发酵条件,得到ND2产纳豆激酶的最佳条件:氮源-大豆蛋白胨,碳源-淀粉,碳氮比3:1,37℃,pH6.0。经PCR扩增得到825bp的纳豆激酶成熟肽基因,采用pET32a(+)表达载体和BL21(DE3)为宿主菌,在温度为37℃、1‰IPTG浓度下可诱导获得较高表达量的重组纳豆激酶。     

纳豆激酶高产菌的快速筛选及其发酵纳豆特性

通过纤溶活性筛选法和纳豆激酶基因筛选法,快速、准确筛选到一株纳豆激酶高产菌株MJ-1,经16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。以黄豆为原料进行固体发酵制备纳豆食品,考察了纳豆食品的纳豆激酶活力、抗凝活性和抗氧化活性。在初始含水量60%、发酵温度37 ℃的条件下,纳豆激酶发酵活力在20 h达到最大值（90.18 FU/g,以干质量计）,达到了商业化纳豆的酶活力水平。抗凝活性分析显示该菌株可合成抗凝成分,赋予纳豆食品抗凝活性,在提取物质量浓度为3 mg/mL时,抗凝效率达91%。同时,与未发酵黄豆相比,发酵过程显著提高了其抗氧化活性。     

豆豉来源的纤溶酶产生菌株的筛选及发酵性能研究

采用酪蛋白平板初筛的方法,从豆豉中分离到278株具有蛋白酶活力的菌株,经过纤维蛋白培养平板复筛,并获得1株产纤溶酶能力较强的菌株,命名为LZ-238。在对LZ-238菌株常规形态学及生理生化特性鉴定的基础上,对部分长度的16SrDNA同源性进行了分析,发现LZ-238菌株与地衣芽孢杆菌相似度达99.5%,命名为Bacillus amyloliquefaciens LZ-238。通过液体发酵及阿胶纳豆的制作,对LZ-238菌株产酶及应用性能进行了评价。经发酵,LZ-238菌株纤溶酶的最高产量可达28.12U/mL,其制作的阿胶纳豆具有豆豉的特有香气且几乎无氨味,更符合中国人的口味。     

微生物产物溶解纤维蛋白活性测定方法的比较

纤维蛋白是血栓的主要组成部分,溶栓药物能溶解血栓主要是溶解血栓中的纤维蛋白。现在广泛研究的纳豆芽孢杆菌之所以具有较强溶血栓的功能主要是它能溶解血栓中的纤维蛋白的原因。比较了两种测定具有溶解纤维蛋白活性(以下简称“溶纤)”菌株活性的方法,从而为筛选具有高溶纤活性菌株提供简易的方法。     

紫外分光光度法测定纳豆激酶体外纤溶活力

建立短时间、定量测定纳豆激酶体外纤溶活力的方法。在体外反应体系中制备血纤维蛋白底物,向体系中加入待测样品(纳豆激酶),进行纤溶反应。用紫外分光光度计测定纳豆激酶水解纤维蛋白后生成的可溶性产物的吸光值。由此对纳豆激酶体外纤溶活性进行定量测定并进行方法可行性分析。该方法具有较好的灵敏度、精密度和准确度,用时短,该方法适用于纳豆激酶体外纤溶活性的定量分析。     

高产纳豆激酶菌株的分离与发酵纳豆过程中生物胺的变化

采用纤溶活性筛选法从贵州织金农家土制烟熏腊肉中分离到一株高产纳豆激酶菌株GULR06,对菌株的菌株形态、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育分析,鉴定该菌株GULR06为枯草芽孢杆菌。以黄豆为主要原料进行固态发酵制备纳豆,通过高效液相色谱法对发酵过程中的生物胺进行检测,同时考察了发酵过程中纳豆激酶活力和生物量的变化。实验表明：尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、酪胺、亚精胺、组胺都能得到很好的分离,且线性关系良好,R2均大于0.994?0,相对标准偏差均小于4%。在纳豆发酵过程中生物胺总量范围在26.47～72.97?mg/kg之间,对人体不构成任何威胁。54?h时,纳豆激酶的酶活力达到最高,为（5?439.5±149）IU/g、活菌数为13（lg（CFU/g））,此时生物胺总量为（56.18±4.94）mg/kg。     

豆豉纤溶酶产生菌的筛选及鉴定

利用纤维蛋白平板筛选和纤溶活性测定相结合的方法，从全国10种豆豉样品中筛选到1株纤溶活性较高的细菌菌株SY-3。通过形态观察和生理生化特征分析，SY-3被初步鉴定为枯草芽孢杆菌。     

纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究

经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶,纯化倍数15.6,回收率10.2%,SDS-PAGE电泳显示为二个组分,分子量在29000左右。对其纤溶性质研究表明:纳豆激酶活性的最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆生理盐水浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。